Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans
Summary
Aquí, se presentan protocolos estandarizados para evaluar la inducción de la respuesta de choque térmico (HSR) en Caenorhabditis elegans usando RT-qPCR a nivel molecular, reporteros fluorescentes a nivel celular y termorecovery a nivel de organismo.
Abstract
La respuesta de choque térmico (HSR) es una respuesta de estrés celular inducida por el desdolicamiento de proteínas citosólicas que funciona para restaurar la homeostasis plegable de proteínas, o proteostasis. Caenorhabditis elegans ocupa un nicho único y poderoso para la investigación de HSR porque el HSR se puede evaluar a niveles moleculares, celulares y del organismo. Por lo tanto, los cambios a nivel molecular se pueden visualizar a nivel celular y sus impactos en la fisiología pueden ser cuantificados a nivel del organismo. Mientras que los ensayos para medir el HSR son sencillos, las variaciones en el tiempo, la temperatura y la metodología descritas en la literatura hacen que sea difícil comparar los resultados entre los estudios. Además, estas cuestiones actúan como una barrera para cualquier persona que busque incorporar el análisis de HSR en su investigación. Aquí, se presenta una serie de protocolos para medir la inducción del HSR de una manera robusta y reproducible con RT-qPCR, reporteros fluorescentes y un ensayo de termorrecupar de organismo. Además, demostramos que un ensayo de termotolerancia ampliamente utilizado no depende del regulador maestro bien establecido del HSR, HSF-1, y por lo tanto no debe utilizarse para la investigación de HSR. Por último, se discuten variaciones en estos ensayos que se encuentran en la literatura y se proponen mejores prácticas para ayudar a estandarizar los resultados en todo el campo, facilitando en última instancia la investigación de enfermedades neurodegenerativas, envejecimiento y HSR.
Introduction
La respuesta de choque térmico (HSR) es una respuesta de estrés celular universal inducida por un error de proteína citosólica causado por aumentos de temperatura y otras tensiones proteóxicas. La activación de la HSR en Caenorhabditis elegans conduce a la regulación transcripcional de genes de choque térmico como hsp-70 y hsp-16.2. Muchas proteínas de choque térmico (HSP) funcionan como chaperones moleculares que restauran la homeostasis plegable de proteínas, o proteostasis, interactuando directamente con proteínas mal plegados o dañados. El regulador maestro del HSR es el factor de transcripción Heat Shock Factor 1 (HSF-1), cuya activación se controla elegantemente a través de múltiples mecanismos1.
El papel de HSF-1 no se limita al estrés. HSF-1 es necesario para el crecimiento y desarrollo normal, ya que la eliminación de hsf-1 conduce a la detención larvaria2. El HSF-1 también es importante durante el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad caracterizadas por la acumulación de agregados proteicos y la incapacidad para mantener la proteostasis. El derribo de hsf-1 causa acumulación de agregados de proteínas y una vida útil acortada, mientras que la sobreexpresión de hsf-1 reduce la agregación de proteínas y prolonga la vida útil3,,4. Por lo tanto, la regulación del HSF-1 a nivel molecular tiene amplias implicaciones para la fisiología y la enfermedad del organismo.
C. elegans es un poderoso organismo modelo para la investigación de HSR porque el HSR se puede medir a los niveles molecular, celular y de organismo4,,5,,6. Destacando el poder de este modelo, se han descubierto avances clave en la delineación de la vía HSR, como las diferencias específicas de tejido en la regulación HSR, en C. elegans7,8. Además, C. elegans es ampliamente utilizado para la investigación del envejecimiento y es un sistema emergente para el modelado de enfermedades relacionadas con la interrupción de la proteostasis.
Aunque los experimentos de choque térmico con C. elegans pueden ser rápidos y reproducibles, hay varias preguntas a considerar antes de comenzar. Por ejemplo, ¿qué temperatura se debe utilizar para la inducción del HSR y cuánto tiempo deben exponerse los gusanos? ¿Es mejor usar una incubadora seca o un baño de agua? ¿Qué etapa de desarrollo se debe utilizar? Desafortunadamente, las metodologías utilizadas para investigar el HSR varían ampliamente de laboratorio a laboratorio, causando confusión al seleccionar las mejores metodologías y dificultando la comparación de resultados en todo el campo.
Presentamos protocolos robustos y estandarizados para el uso de RT-qPCR, reporteros fluorescentes y termorecovery para medir el HSR. Si bien estos tres enfoques son complementarios, cada uno tiene ventajas y desventajas únicas. Por ejemplo, RT-qPCR es la medición más directa y cuantitativa del HSR, y este ensayo se puede ampliar fácilmente para incluir muchos genes diferentes inducibles por choques térmicos. Sin embargo, RT-qPCR es el más caro, puede ser técnicamente difícil, y requiere el uso de equipos especializados. Por el contrario, los reporteros fluorescentes tienen la ventaja de medir las diferencias específicas de los tejidos en la inducción de HSR. Sin embargo, son difíciles de cuantificar con precisión, sólo pueden medir la inducción por encima de un determinado umbral y requieren el uso de un microscopio de fluorescencia. Además, las cepas reporteras descritas aquí se retrasan en el desarrollo en comparación con la cepa N2 estándar. Aunque las cepas de reporteros más recientes que contienen transgenes de copia única están disponibles, no se han probado aquí9. El tercer ensayo, el termorecovery, tiene la ventaja de proporcionar una lectura fisiológicamente relevante a nivel del organismo. Sin embargo, este ensayo es sin duda el menos sensible y más indirecto. Por último, analizamos algunas variaciones comunes que se encuentran en estos ensayos y proponemos un conjunto de mejores prácticas para facilitar la investigación en este campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la literatura se ha utilizado una amplia variedad de temperaturas, tiempos y equipos para ensayar el HSR, lo que ha introducido advertencias innecesarias y ha llevado a dificultades para comparar los resultados entre los laboratorios. Por ejemplo, se han utilizado temperaturas que oscilan entre 32-37 oC y tiempos de 15 min a varias horas para inducir el HSR15. Sin embargo, se informa que la letalidad ocurre tan pronto como 3 h a 37 oC para todas las etapas y 1,5 h para el día 1adultos 15. Además, mostramos que la exposición de gusanos a 35 oC causa letalidad que no depende de HSF-1, lo que hace que estas condiciones no sean adecuadas para el análisis del HSR. Por el contrario, un choque térmico de 33 oC durante 1 h es lo suficientemente robusto como para provocar una fuerte inducción de genes de choque térmico, pero lo suficientemente leve como para no afectar la viabilidad del gusano. De hecho, la exposición a 33 oC durante 6 h sólo hace que el 20% de los gusanos muestren un movimiento anormal. Por lo tanto, proponemos utilizar una temperatura de 33 oC y un tiempo de 1 h como condición estandarizada para RT-qPCR y ensayos fluorescentes de reportero.
Experimentos recientes han revelado que la puesta en escena del desarrollo de gusanos para experimentos con HSR es particularmente importante. Recientemente se demostró que en C. elegans la inducibilidad de los descensos de HSR (es decir, colapsos) por >50% cuando los hermafroditas comienzan a poner huevos5. La estadificación correcta de los gusanos es fundamental porque a menudo hay diferencias en el tiempo de desarrollo en las cepas portadoras de mutaciones. Si se utilizan mutantes sensibles a la temperatura, esto también afectará a los resultados si no están sincronizados por su edad reproductiva. Por lo tanto, se recomienda medir cuidadosamente el inicio de la puesta de huevos para cada cepa para determinar cuándo se produce el colapso. La ventana de tiempo después de la muda L4 y antes del inicio de la madurez reproductiva es estrecha; por lo tanto, se debe tener cuidado para que el colapso del HSR no cause inadvertidamente variabilidad en los resultados.
Además de la sincronización del desarrollo, sorprendentemente pequeños cambios en la temperatura, tan poco como 1 oC, pueden tener efectos sustanciales en el HSR. Por ejemplo, las neuronas termosensoriales en C. elegans son sensibles a cambios de temperatura tan pequeños como 0,05 oC16. Por lo tanto, es imperativo utilizar un termómetro que pueda medir con precisión la temperatura. Por lo tanto, proponemos como mejor práctica el uso de un dispositivo calibrado para la medición de la temperatura que sea lo suficientemente preciso como para medir las temperaturas dentro de 0,1 oC. Además, se debe utilizar un termómetro con una funcionalidad de registro de datos para medir las variaciones de temperatura a lo largo del tiempo. Muchas incubadoras se especifican para tener variaciones térmicas de más de 1 oC en diferentes partes de la incubadora y a través del tiempo, lo que puede tener efectos significativos en los experimentos de HSR. Como práctica recomendada, sugerimos el uso de incubadoras que tienen suficiente aislamiento y circulación para minimizar las fluctuaciones de temperatura. Para llevar a cabo experimentos de choque térmico, proponemos una mejor práctica de un baño de agua circulante. El tiempo que tarda una placa de agar para alcanzar la temperatura deseada es de aproximadamente 6-7 min en un baño de agua, pero mucho más tiempo en una incubadora seca15,17. Sin embargo, si no hay un baño de agua circulante disponible, hemos demostrado que la inducción robusta de HSR también ocurre en una incubadora seca utilizando nuestras condiciones. Si se utiliza una incubadora seca, se debe minimizar la apertura de la incubadora durante la duración de la tensión.
Está bien establecido que la inducción de genes de choque térmico depende del regulador maestro del HSR, HSF-1. Aquí, presentamos evidencia de que los dos ensayos más indirectos, los reporteros fluorescentes y el termorecovery, también dependen de HSF-1. Significativamente, encontramos que un ensayo de organismal alternativo de uso común, la termotolerancia, no depende de HSF-1 utilizando hsf-1 RNAi (Figura 4). Resultados similares se han reportado previamente usando un mutante hsf-1 o un mutante ttx-3, que bloquea el HSR18,,19,20. Juntos, estos resultados indican que el ensayo de termotorlerancia no debe utilizarse para la investigación de HSR. Además, esto sugiere que una mejor práctica es probar la dependencia del HSF-1 para cualquier ensayo utilizado para medir el HSR.
En conjunto, presentamos una serie de protocolos estandarizados y mejores prácticas para la medición robusta y reproducible de la inducción de HSR en C. elegans. Esperamos que estas metodologías disminuyan la variabilidad en los experimentos con HSR y aumenten la reproducibilidad. Facilitar las comparaciones directas de la investigación de HSR entre laboratorios servirá para acelerar la investigación en el campo de la HSR. Además, la estandarización beneficiará a la investigación sobre el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas con las que el HSR está íntimamente asociado.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una donación de Frank Leslie. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de niH (P40 OD010440).
Materials
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
- Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
- Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
- Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology – Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
- Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
- Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
- Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
- McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
- Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
