أساليب موحدة لقياس التعريفي من استجابة الصدمة الحرارية في الكينورهابيتس elegans
Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكولات موحدة لتقييم تحريض استجابة الصدمة الحرارية (HSR) في الكينورهاب elegans باستخدام RT-qPCR على المستوى الجزيئي، المراسلين الفلورسنت على المستوى الخلوي، و ثيرمورcovery على مستوى الكائنات الحية.
Abstract
استجابة الصدمة الحرارية (HSR) هي استجابة الإجهاد الخلوية الناجمة عن التطويع الخاطئ للبروتين الخلوي الذي يعمل على استعادة التوازن البروتيني القابل للطي ، أو البروتيوستاسيس. يحتل اليجانز Caenorhabditis مكانة فريدة وقوية لأبحاث HSR لأنه يمكن تقييم HSR على المستويات الجزيئية والخلوية والكائنات الحية. ولذلك، يمكن تصور التغيرات على المستوى الجزيئي على المستوى الخلوي ويمكن أن تكون آثارها على علم وظائف الأعضاء كمية على مستوى الكائنات الحية. في حين أن عمليات القياس لقياس HSR واضحة ، فإن الاختلافات في التوقيت ودرجة الحرارة والمنهجية الموصوفة في المؤلفات تجعل من الصعب مقارنة النتائج عبر الدراسات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه القضايا تشكل حاجزاً أمام أي شخص يسعى إلى دمج تحليل HSR في أبحاثه. هنا، يتم عرض سلسلة من البروتوكولات لقياس التعريفي HSR بطريقة قوية وقابلة للتكرار مع RT-qPCR، والمراسلين الفلورسنت، ومقايسة ثيرموروري كائن حي. بالإضافة إلى ذلك، نُظهر أن فحص الحرارة المستخدم على نطاق واسع لا يعتمد على المنظم الرئيسي الراسخ لـ HSR، HSF-1، وبالتالي لا ينبغي استخدامه في أبحاث HSR. وأخيراً، تناقش الاختلافات في هذه المقايسات الموجودة في المؤلفات وتقترح أفضل الممارسات للمساعدة في توحيد النتائج في جميع أنحاء الميدان، مما يسهل في نهاية المطاف الأمراض العصبية، والشيخوخة، والبحوث HSR.
Introduction
استجابة الصدمة الحرارية (HSR) هي استجابة عالمية للإجهاد الخلوي الناجم عن التطيّع الخاطئ للبروتين الخلوي الناجم عن زيادة درجات الحرارة والضغوط الأخرى المسببة للبروتين. يؤدي تنشيط HSR في Caenorhabditis elegans إلى النسخ إلى أعلى من جينات الصدمة الحرارية مثل hsp-70 و hsp-16.2. تعمل العديد من بروتينات الصدمات الحرارية (HSPs) كمرافقين جزيئيين يستعيدون التوازن القابل للطي للبروتين ، أو البروتيوستاسيس ، من خلال التفاعل المباشر مع البروتينات المُطَوَّلة أو التالفة. المنظم الرئيسي للHSR هو عامل النسخ الحرارة صدمة عامل 1 (HSF-1)، الذي يتم التحكم في تفعيل بأناقة عن طريق آليات متعددة1.
لا يقتصر دور HSF-1 على الإجهاد. HSF-1 مطلوب للنمو والتطور الطبيعي، حيث يؤدي حذف hsf-1 إلى اعتقالاليرقات 2. HSF-1 مهم أيضا خلال الشيخوخة والأمراض العصبية المرتبطة بالعمر التي تتميز بتراكم البروتينات المجاميع وعدم القدرة على الحفاظ على البروتيوستاسيس. الضربة القاضية من hsf-1 يسبب تراكم المجاميع البروتين وعمر تقصير، في حين أن overexpression من hsf-1 يقلل من تجميع البروتين ويطيل عمر3،4. ولذلك، فإن تنظيم النظام HSF-1 على المستوى الجزيئي له آثار واسعة النطاق على فسيولوجيا الكائنات الحية والمرض.
C. elegans هو كائن حي نموذج قوي لبحوث HSR لأن HSR يمكن قياسها في المستويات الجزيئية والخلوية والكائنات الحية4,5,6. تسليط الضوء على قوة هذا النموذج، تم اكتشاف التطورات الرئيسية في تحديد مسار HSR، مثل الاختلافات الخاصة بالأنسجة في تنظيم HSR، في C. elegans7،8. وعلاوة على ذلك، يستخدم على نطاق واسع C. elegans لأبحاث الشيخوخة وهو نظام ناشئ النمذجة الأمراض المرتبطة اضطراب البروتيوستاسيس.
على الرغم من أن تجارب الصدمة الحرارية مع C. elegans يمكن أن تكون سريعة وقابلة للتكرار ، هناك العديد من الأسئلة التي يجب مراعاتها قبل البدء. على سبيل المثال، ما هي درجة الحرارة التي ينبغي استخدامها للتحريض على HSR وإلى متى ينبغي أن تتعرض الديدان؟ هل من الأفضل استخدام حاضنة جافة أو حمام مائي؟ ما هي المرحلة التطويرية التي ينبغي استخدامها؟ لسوء الحظ، تختلف المنهجيات المستخدمة في دراسة HSR بشكل كبير من مختبر إلى مختبر، مما يسبب الارتباك عند اختيار أفضل المنهجيات ويجعل من الصعب مقارنة النتائج عبر الميدان.
نقدم بروتوكولات قوية وموحدة لاستخدام RT-qPCR، ومراسلي الفلورسنت، وثيرموروريتي لقياس HSR. وفي حين أن هذه النهج الثلاثة يكمل بعضها بعضا، فإن لكل منها مزايا وعيوبا فريدة. على سبيل المثال، RT-qPCR هو القياس الأكثر مباشرة والكمية من HSR، ويمكن بسهولة توسيع هذا الفحص لتشمل العديد من الجينات المختلفة للصدمات الحرارية غير القابلة للاختزال. ومع ذلك، RT-qPCR هو أغلى، يمكن أن يكون صعبا من الناحية الفنية، ويتطلب استخدام المعدات المتخصصة. وعلى النقيض من ذلك، يتمتع المراسلون الفلورسنت بميزة قياس الاختلافات الخاصة بالأنسجة في تحريض HSR. ومع ذلك ، من الصعب أن quantitate بدقة ، يمكن قياس الاستقراء فقط فوق عتبة معينة ، وتتطلب استخدام مجهر الفلوريسنس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سلالات المراسل الموصوفة هنا تتأخر تطورًا مقارنة بسلالة N2 القياسية. على الرغم من أن أحدث مراسل سلالات تحتوي على transgenes نسخة واحدة متوفرة، لم يتم اختبارها هنا9. التشايس الثالث، thermorecovery، لديه ميزة توفير قراءات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية على مستوى الكائنات الحية. ومع ذلك، يمكن القول إن هذا الفحص هو الأقل حساسية والأكثر غير مباشر. وأخيراً، نناقش بعض الاختلافات الشائعة الموجودة في هذه المقايسات ونقترح مجموعة من أفضل الممارسات لتسهيل البحث في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الأدب مجموعة واسعة من درجات الحرارة، والأوقات، والمعدات وقد استخدمت لمقارنه HSR، والتي أدخلت المحاذير لا لزوم لها، وأدت إلى صعوبة في مقارنة النتائج بين المختبرات. على سبيل المثال، استخدمت درجات الحرارة التي تتراوح بين 32-37 درجة مئوية والأوقات من 15 دقيقة إلى عدة ساعات للحث على HSR15. ومع ذلك، أفيد أن الفتك يحدث في وقت مبكر من 3 ح في 37 درجة مئوية لجميع المراحل و 1.5 ساعة لليوم 1 الكبار15. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر أن التعرض للدود إلى 35 درجة مئوية يسبب الفتك الذي لا يعتمد HSF-1، مما يجعل هذه الظروف غير مناسبة لتحليل HSR. في المقابل، صدمة حرارية من 33 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قوية بما يكفي لإثارة تحريض قوي من الجينات صدمة الحرارة، ومع ذلك خفيفة بما يكفي لعدم التأثير على قابلية بقاء الدودة. في الواقع ، التعرض ل33 درجة مئوية لطالما 6 ح فقط يسبب 20 ٪ من الديدان لعرض حركة غير طبيعية. لذلك، نقترح استخدام درجة حرارة 33 °C ووقت 1 ساعة كشرط موحد لـ RT-qPCR وRr الفلورسنت.
وقد كشفت التجارب الأخيرة أن التدريج التنموي للدودة لتجارب HSR مهم بشكل خاص. وقد تبين مؤخرا أن في C. elegans inducibility من HSR يتراجع (أي، ينهار) من قبل > 50٪ عندما تبدأ hermaphrodites وضع البيض5. التدريج الديدان بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية لأن هناك في كثير من الأحيان اختلافات في توقيت النمو في سلالات تحمل الطفرات. إذا تم استخدام المسوخ الحساسة لدرجة الحرارة ، فإن هذا سيؤثر أيضًا على النتائج إذا لم يتم مزامنةها مع سن الإنجاب. ولذلك، فمن المستحسن لقياس بعناية بداية وضع البيض لكل سلالة لتحديد متى يحدث الانهيار. نافذة الوقت بعد الزلت L4 وقبل بدء مرحلة النضج الإنجابية ضيقة؛ لذلك، يجب توخي الحذر بحيث لا يؤدي انهيار HSR عن غير قصد إلى حدوث تباين في النتائج.
بالإضافة إلى توقيت النمو، يمكن أن يكون للتغيرات الصغيرة بشكل مدهش في درجة الحرارة، أقل من 1 درجة مئوية، آثار كبيرة على HSR. على سبيل المثال، الخلايا العصبية الحرارية في C. elegans حساسة لتغيرات درجة الحرارة صغيرة مثل ± 0.05 درجة مئوية16. وبالتالي ، لا بد من استخدام ميزان الحرارة الذي يمكن قياس درجة الحرارة بدقة. لذلك، نقترح كأفضل ممارسة استخدام جهاز معاير لقياس درجة الحرارة دقيقة بما يكفي لقياس درجات الحرارة داخل ± 0.1 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، ينبغي استخدام ميزان حرارة مع وظيفة تسجيل البيانات لقياس التغيرات في درجة الحرارة عبر الزمن. يتم تحديد العديد من الحاضنات أن يكون لها اختلافات حرارية تزيد عن 1 درجة مئوية في أجزاء مختلفة من الحاضنة وعبر الزمن، والتي يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على تجارب HSR. وكفضل الممارسات، نقترح استخدام حاضنات تحتوي على عزل ودورة كافية لتقليل تقلبات درجات الحرارة. لإجراء تجارب الصدمة الحرارية، نقترح أفضل ممارسة من حمام المياه المتداولة. الوقت الذي يستغرقه لطبقة أجار للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة هي ما يقرب من 6-7 دقيقة في حمام مائي ولكن لفترة أطول بكثير في حاضنة جافة15،17. ومع ذلك، إذا كان حمام المياه المتداولة غير متوفرة، فقد أظهرنا أن التوجيهية HSR قوية يحدث أيضا في حاضنة جافة باستخدام شروطنا. إذا تم استخدام حاضنة جافة ، يجب تقليل فتح الحاضنة طوال فترة الإجهاد.
ومن الثابت أن تحريض الجينات صدمة الحرارة يعتمد على المنظم الرئيسي للHSR، HSF-1. هنا، نقدم أدلة على أن اثنين من أكثر غير المباشرة المقايسة، المراسلين الفلورسنت وsrmorecovery، وتعتمد أيضا على HSF-1. بشكل ملحوظ، وجدنا أن يشيا الكائنات الحية البديلة المستخدمة عادة، thermotolerance، ليست HSF-1 تعتمد باستخدام HSF-1 RNAi(الشكل 4). وقد تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة سابقا باستخدام متحولة hsf-1 أو متحولة ttx-3، الذي يمنع HSR18،19،20. معا، وهذه النتائج تشير إلى أن المقايسة الحرارية لا ينبغي أن تستخدم لأبحاث HSR. وعلاوة على ذلك، يشير هذا إلى أن أفضل الممارسات هي اختبار الاعتماد على HSF-1 لأي محك يستخدم لقياس HSR.
معا، ونحن نقدم سلسلة من البروتوكولات الموحدة وأفضل الممارسات لقياس قوية وقابلة للتكرار من التعريفي HSR في C. elegans. ونأمل أن تقلل هذه المنهجيات من التباين في تجارب HSR وتزيد من إمكانية التكاثر. إن تسهيل المقارنات المباشرة بين المختبرات سوف يساعد على تسريع البحوث في مجال HSR. وعلاوة على ذلك، فإن التوحيد القياسي سوف يفيد البحوث في الشيخوخة وأمراض التنكس العصبي التي ترتبط بها HSR ارتباطا وثيقا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل هبة من فرانك ليزلي. وقد تم توفير بعض السلالات من قبل CGC، التي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).
Materials
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
- Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
- Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
- Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology – Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
- Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
- Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
- Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
- McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
- Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
