Över 80% av proteiner beräknas ha interaktioner med andra^{molekyler 1}, vilket betonar hur viktigt protontonitet är för utförandet av specifika biologiska funktioner i cellen². Vissa proteiner fungerar som nav som underlättar montering av större komplex som är nödvändiga för cellöverlevnad¹. Dessa nav förmedlar flera probehörningar och hjälper till att organisera proteiner i ett nätverk som underlättar specifika funktioner i en cell³. Bildandet av proteinkomplex påverkas också av biologiskt sammanhang, såsom närvaron eller frånvaron av specifika samverkande partners^4,cellsignalering händelser, och utvecklingsstadiet av en cell.

C. elegans används ofta som modellorganism för en mängd olika studier, inklusive utveckling. Den enkla anatomin hos detta djur består av flera organ, inklusive gonad, tarm, och transparent nagelband, vilket underlättar analysen av maskutveckling. Den sett som bor i gonaden är ett bra verktyg för att studera hur sett stamceller mogna till könsceller⁵ som utvecklas till embryon och så småningom nästa generation av avkomma. Den distala spetsregionen i könscellerna innehåller en pool av självförnyande stamceller (figur 1). När stamceller lämnar nischen går de vidare till den meiotiska pachytenen och utvecklas så småningom till äggceller i det unga vuxna stadiet (figur 1). Detta utvecklingsprogram i setten är hårt reglerat genom olika mekanismer, inklusive ett regleringsnätverk efter transkription som underlättas av RNA-bindande proteiner (RBPs)⁶. Prothämmare är viktiga för denna regleringsverksamhet, eftersom ringpärmsmekanismer associerar med andra kofaktorer för att utöva sina uppgifter.

Det finns flera metoder som kan användas för att söka efter protoniteter i masken, men var och en har unika begränsningar. In vivo immunoprecipitation (IP) kan användas för att isolera protein-proteinkomplex från hela maskextrakt; Den här metoden anger dock inte var PPI förekommer i masken. Dessutom kan proteinkomplex som är övergående och endast bildas under ett visst utvecklingsstadium eller i ett begränsat antal celler vara svåra att återhämta sig genom samimmunprecipitation. Slutligen måste IP-experiment ta itu med problemen med proteinkomplex reassortment efter lys och icke-specifik retention av proteiner på affinitetsmatrisen.

Alternativa metoder för in situ detektion av prokrommor är co-immunostaining, Förster resonans energiöverföring (FRET), och bimolekylära fluorescenskomplementation (BiFC). Co-immunostaining bygger på samtidig detektion av två proteiner av intresse för fast mask vävnad och mätning av omfattningen av signal colocalization. Användning av super-upplösning mikroskopi, som erbjuder större detaljrikare än standardmikroskopi⁷, hjälper till att strängare testa protein kolacalisering utöver diffraktion-begränsad barriär på 200-300 nm⁸. Men co-immunostaining med både konventionella och super-upplösning mikroskopi fungerar bäst för proteiner med väldefinierade lokalisering mönster. Däremot blir det mycket mindre informativt för diffust distribuerade interagerande partners. Mätning för samlokalisering av signaler baserade på överlappning ger inte korrekt information om huruvida proteinerna är i komplex med varandra^9,10.

Dessutom är samimmunitet och co-immunostaining av protein-proteinkomplex inte kvantitativa, vilket gör det svårt att avgöra om sådana interaktioner är betydande. FRET och BiFC är båda fluorescerande-baserade tekniker. FRET bygger på märkning av proteiner av intresse med fluorescerande proteiner (FPs) som har spektral överlappning vid vilken energi från en FP (givare) överförs till en annan FP (acceptor)¹¹. Denna icke-strålningsöverföring av energi resulterar i fluorescens hos acceptor FP som kan detekteras vid dess respektive våglängd av utsläpp. BiFC är baserad på rekonstituering av ett fluorescerande protein in vivo. Det innebär att dela GFP i två kompletterande fragment, såsom helices 1-10 och helix 11¹², som sedan smälts till två proteiner av intresse. Om dessa två proteiner samverkar, blir de kompletterande fragmenten av GFP tillräckligt nära i närheten av att vika och montera, rekonstruera GFP-fluorofore. Rekonstituerat genetiskt nytt liv observeras sedan direkt som fluorescens och anger var ett PPI har inträffat.

Som sådan, både FRET och BiFC beror på stora fluorescerande taggar som kan störa funktionen av taggade proteinet. Dessutom kräver FRET och BiFC rikligt och jämförbart uttryck för de taggade proteinerna för att få korrekta data. FRET kanske inte är lämpligt för experiment där en partner är över den andra, vilket kan leda till hög bakgrund¹³. Överuttryck i BiFC-experiment bör också undvikas, eftersom detta kan framkalla ospecifik montering¹⁴ som resulterar i ökad bakgrund. Båda teknikerna kräver optimering av uttryck och bildframställning villkor för taggade proteiner, vilket kan förlänga den tid som krävs för att slutföra experiment.

Den närhet ligering analys (PLA) är ett alternativt tillvägagångssätt som kan ta itu med begränsningarna i de tekniker som nämns ovan. PLA drar nytta av primära antikroppar som känner igen proteiner av intresse (eller deras taggar). Dessa primära antikroppar binds sedan av sekundära antikroppar som innehåller oligonukleotidsonder som kan hybridiseras med varandra när de ligger inom ett avstånd på 40 nm (eller kortare)¹⁵. Den resulterande hybridiserade DNA förstärks genom en PCR-reaktion, som detekteras av sonder som kompletterar DNA. Detta resulterar i högborgar som visualiseras av ett mikroskop. Denna teknik kan upptäcka protontontonala institut på plats i komplexa vävnader (dvs. masken gonad), som är organiserad som en löpande band som innehåller celler i olika stadier av utveckling och differentiering. Med PLA kan protonger visualiseras direkt i en fast mask gonad, vilket är fördelaktigt för att undersöka om protonger uppstår under ett visst utvecklingsstadium. PLA erbjuder större upplösning av probetalare i motsats till samlokaliseringsbaserade analyser, som är idealiska för att göra exakta mätningar. Om den används, super-upplösning mikroskopi har potential att ge finare detaljer om placeringen av PLA foci i en cell. En annan fördel är att foci till följd av PLA-reaktioner kan räknas av ett ImageJ-baserat analysarbetsflöde, vilket gör denna teknik kvantitativ.

LC8-familjen av dynein ljuskedjor beskrevs först som en underavdelning av dynein motorkomplex¹⁶ och hypotesen att fungera som en last adapter. Sedan den första upptäckten, LC8 har hittats i flera proteinkomplex utöver dynein motorkomplex^17,18,19,20. Scanning för proteinsekvenser som innehåller LC8 interaktion motiv¹⁹ tyder på att LC8 kan ha många interaktioner med ett brett utbud av olika proteiner^{17,18,19,20,21,22}. Som ett resultat, LC8 familj proteiner anses nu nav som bidrar till att främja montering av större proteinkomplex^19,22, såsom församlingar av inneboende oordnade proteiner²¹.

Ett C. elegans LC8-familjens protein, dynein ljuskedja-1 (DLC-1), uttrycks brett över många vävnader och inte berikas i specifika subcellulära strukturer^23,,24. Följaktligen är identifiering av biologiskt relevanta in vivo-partners för DLC-1 i C. elegans utmanande av flera skäl: 1) samimmunitetsförfällning anger inte vävnadskällan där interaktionen sker. 2) begränsat uttryck för vissa partners eller övergående interaktioner kan hindra förmågan att upptäcka en interaktion genom samimmunprecipitation; och 3) diffus fördelning av DLC-1 leder till icke-specifik överlappning med potentiella partnerproteiner genom co-immunostaining. Baserat på dessa utmaningar är PLA en idealisk metod för att testa in vivo-interaktioner med DLC-1.

Det har tidigare rapporterats att DLC-1 direkt interagerar med och fungerar som en kofaktor för RNA-bindande proteiner (RBPs) FBF-2²³ och GLD-1²⁵. Vårt arbete stöder modellen av DLC-1 fungerar som ett nav protein och föreslår att DLC-1 underlättar ett interaktionsnätverk som sträcker sig bortom dynein^19,22. Med hjälp av en GST pulldown-analys har en ny DLC-1-interacting RBP med namnet OMA-1 identifierats²⁶. OMA-1 är viktigt för äggcellstillväxt och meiotisk mognad²⁷ och fungerar tillsammans med ett antal translationella förtryckare och aktivatorer²⁸. Medan FBF-2 och GLD-1 uttrycks i stamceller och meiotiska pachytene regioner, respektive, OMA-1 är diffust uttryckt i könsceller från den meiotiska pachyten genom äggceller²⁷ (figur 1). Detta tyder på att DLC-1 bildar komplex med ringpärmsmekanismer i olika regioner i gonaden. Det har också visat sig att den direkta interaktionen mellan DLC-1 och OMA-1 observerade in vitro inte återvinns genom en in vivo IP. PLA har framgångsrikt använts som en alternativ metod för att ytterligare studera denna interaktion i C. elegans sett, och resultaten tyder på att PLA kan användas för att söka många andra protonger i masken.