מעל 80% של חלבונים מוערכים יש אינטראקציות עם מולקולות אחרות¹, אשר מדגיש כיצד ppis חשוב לביצוע של פונקציות ביולוגיות ספציפיות בתא². חלבונים מסוימים לתפקד כרכזות ההקלה על הרכבה של מתחמים גדולים יותר הנחוצים עבור הישרדות התא¹. רכזות אלה מתווך PPIs מרובים ולעזור לארגן חלבונים לתוך רשת המאפשרת פונקציות ספציפיות בתא³. היווצרות של מכלולי חלבון מושפע גם על ידי הקשר הביולוגי, כגון נוכחות או היעדרות של שותפים ספציפיים אינטראקציה⁴, תא איתות אירועים, ובשלב ההתפתחותי של תא.

ג. אלגיה משמשת בדרך כלל כאורגניזם מודל למגוון מחקרים, כולל פיתוח. האנטומיה הפשוטה של בעל החיים מורכבת ממספר איברים, כולל הגונאד, הבטן והקוטיקולה השקופה, המאפשרת ניתוח של פיתוח תולעים. את germline המתגוררים לוטה הוא כלי נהדר ללמוד כיצד בתאי גזע germline בוגרים לתוך גמטות⁵ המתפתחים לעוברים ובסופו של דבר הדור הבא של צאצאי. אזור הקצה המרוחק של הגרמקו (germline) מכיל מאגר של תאי גזע המחדשים את עצמם (איור 1). כמו תאי גזע לעזוב את הנישה, הם התקדמות לתוך pachytene המיון ובסופו של דבר להתפתח oocytes בשלב המבוגר הצעיר (איור 1). תוכנית זו של פיתוח ב-germline מוסדר באופן הדוק באמצעות מנגנונים שונים, כולל רשת לאחר ההמרה הרגולציה הקלה על ידי ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs)⁶. PPIs חשוב עבור פעילות תקינה זו, כמו RBPs שותף עם קופנים אחרים כדי להפעיל את הפונקציות שלהם.

ישנן מספר גישות שניתן להשתמש בהן כדי לחקור עבור PPIs בתולעת, אבל לכל אחד יש מגבלות ייחודיות. ב vivo IMMUNOPRECIPITATION (IP) ניתן להשתמש כדי לבודד חלבון חלבון מתחמי מתמציות תולעת שלמות; עם זאת, גישה זו אינה מציינת היכן ה-PPI מתרחשת בתולעת. בנוסף, מתחמי חלבון כי הם ארעי ורק טופס במהלך שלב מסוים של פיתוח או במספר מוגבל של תאים יכול להיות קשה להתאושש על ידי co-immunoprecipitation. לבסוף, ניסויים בקניין רוחני צריכים לטפל בחששות של מורכבות חלבון לאחר הליזה ושימור לא ספציפי של חלבונים על מטריצת הזיקה.

גישות חלופיות לאיתור באתרו של ppis כתמים שיתוף חיסוני, Förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג), ומשלימה ביולקולרית הקומפלמנטציה (bimolecular). שיתוף חיסוני מסתמך על זיהוי סימולטני של שני חלבונים של עניין רקמת תולעת קבועה ומדידה של היקף לוקליזציה של אות. שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, המציעה פירוט רב יותר מאשר המיקרוסקופיה הסטנדרטית⁷, מסייע באופן מדוקדק יותר לבדוק לוקליזציה חלבון מעבר למכשול עקיפה-מוגבל של 200-300 ננומטר⁸. עם זאת, התאמה חיסונית משותפת באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונאלי ברזולוציה סופר עובד הטוב ביותר עבור חלבונים עם דפוסי לוקליזציה מוגדרים היטב. לעומת זאת, הוא הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לשותפים בעלי אינטראקציה מבוזרת. מדידה להתאמה משותפת של אותות המבוססים על חפיפה אינה מספקת מידע מדויק על האם החלבונים מורכבים זה מזה^9,10.

יתר על כן, co-immunoprecipitation ושיתוף חיסוני של מכלולי חלבון-חלבון אינם כמותיים, מה שהופך אותו מאתגר כדי לקבוע אם אינטראקציות כאלה הן משמעותיות. מדובר בשתי טכניקות המבוססות על פלורסנט. מסתמך על תיוג חלבונים של עניין עם חלבונים פלורסנט (FPs) כי יש חפיפה ספקטרלית שבה אנרגיה מאחד FP (תורם) מועבר אחר FP (קבלה)¹¹. זו העברה לא רדיוטיבית של תוצאות האנרגיה הפלואורסצנטית של הקבלה FP שניתן לזהות בתוך הגל המתאים של פליטה. BiFC מבוססת על החוקה של חלבון פלורסנט ב vivo. זה כרוך בפיצול GFP לשני שברים משלימים, כגון ה1-10 ו סליל 11¹², אשר התמזגו אז שני חלבונים של ריבית. אם שני החלבונים האלה אינטראקציה, השברים המשלימים של GFP להיות קרובים מספיק בסמיכות לקפל ולהרכיב, המהווים מחדש את fluorophore GFP. מחדש GFP הוא הבחין במישרין כמו פלואורסצנטית ומציין היכן PPI התרחשה.

ככזה, הן גם לדאוג וגם BiFC תלוי תגי פלורסנט גדול שיכול לשבש את הפונקציה של חלבון מתויג. בנוסף, יש לבקש ממנו ביטוי שופע ודומה של החלבונים המתויגים להשגת נתונים מדויקים. לא ניתן להתאים לניסויים שבהם שותף אחד הוא עודף של השני, אשר יכול להוביל לרקע גבוה¹³. ביטוי יתר בניסויים BiFC יש גם להימנע, כי זה יכול לגרום להרכבה לא ספציפית¹⁴ כי התוצאה היא מוגברת הרקע. שתי הטכניקות דורשות אופטימיזציה של הביטוי ותנאי הדימות של חלבונים מתויגים, אשר עשוי להאריך את הזמן הנדרש כדי להשלים ניסויים.

הטיפול הצמוד (PLA) הוא גישה חלופית שיכולה לטפל במגבלות הטכניקות המוזכרות לעיל. PLA מנצל את הנוגדנים העיקריים המכירים את חלבוני הריבית (או התגים שלהם). נוגדנים ראשוניים אלה מאוגדים לאחר מכן על ידי נוגדנים משניים המכילים בדיקה מחדש של olig, שיכולים לhybridize אחד עם השני כאשר בתוך 40 ננומטר (או קצר) מרחק¹⁵. ה-DNA הוכלא כתוצאה מוגבר באמצעות תגובת PCR, אשר מזוהה על ידי בדיקות המשלימים את ה-DNA. זה התוצאות וקדי כי הם דמיינו על ידי מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו יכולה לזהות PPIs באתרו רקמות מורכבות (כלומר, gonad התולעת), אשר מאורגן כקו הרכבה המכיל תאים בשלבים שונים של פיתוח ובידול. עם PLA, PPIs יכול להיות במישרין דמיינו בתוך gonad תולעת קבועה, אשר יתרון עבור חקירת האם PPIs להתרחש במהלך שלב ספציפי של פיתוח. PLA מציע ברזולוציה גבוהה יותר של PPIs לעומת שיתוף לוקליזציה מבוסס assays אשר הוא אידיאלי לעשיית מדידות מדויקות. אם נעשה שימוש, מיקרוסקופ סופר-רזולוציה יש את הפוטנציאל לספק פרטים דקים יותר על המיקום של PLA וקדי בתוך תא. יתרון נוסף הוא כי וקדי הנובע מתגובות PLA ניתן לספור על ידי זרימת עבודה מבוססי imagej ניתוח, מה שהופך את הטכניקה הזאת כמותית.

המשפחה LC8 של שרשראות האור דינאין תוארה לראשונה כיחידת משנה של דינאין מנוע קומפלקס¹⁶ ו היפותזה לשמש מתאם המטען. מאז התגלית הראשונית שלה, LC8 נמצא מתחמי חלבון מרובים בנוסף למתחם דינאין מנוע^17,18,19,20. סריקת רצפי חלבונים המכילים את מוטיב LC8 אינטראקציה¹⁹ מציע כי LC8 יכול להיות הרבה אינטראקציות עם מגוון רחב של חלבונים שונים^{17,18,19,20,21,22}. כתוצאה מכך, חלבונים LC8 משפחתיים נחשבים כעת רכזות המסייעות לקדם את ההרכבה של מכלולי חלבון גדולים יותר^19,22, כגון מכלולים של חלבונים בעלי סדר מבחינה מיסודה²¹.

אחד C. אלגיה LC8-חלבון משפחה, דינאין אור שרשרת-1 (DLC-1), מבוטא באופן נרחב על פני רקמות רבות ולא מועשר מבנים ספציפיים subcellular^23,24. כתוצאה מכך, זיהוי של רלוונטיות ביולוגית בvivo שותפים של DLC-1 ב -C. אלגיה מאתגרת מספר סיבות: 1) co-immunoprecipitation אינו מצביע על מקור הרקמה שבו האינטראקציה מתרחשת; 2) ביטוי מוגבל של שותפים מסוימים או אינטראקציות ארעי עלול לעכב את היכולת לזהות אינטראקציה על ידי co-immunoprecipitation; ו-3) לפזר התפלגות של DLC-1 מוביל חפיפה לא ספציפית עם חלבונים שותפים פוטנציאליים על ידי שיתוף חיסוני. בהתבסס על האתגרים הללו, PLA היא גישה אידיאלית לבחינות באינטראקציות vivo עם DLC-1.

בעבר דווח כי DLC-1 מקיים אינטראקציה ישירה עם ומשמש כקופקטור עבור ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) FBF-2²³ ו gld-1²⁵. העבודה שלנו תומכת במודל של dlc-1 לשמש כחלבון hub ומציע dlc-1 מקלה על רשת אינטראקציה המתפרס מעבר דינאין^19,22. באמצעות השיטה הנפתחת GT, מחדש DLC-1-אינטראקציה RBP בשם OMA-1 זוהה²⁶. OMA-1 חשוב עבור צמיחה oocyte ו meiotic התבגרות²⁷ פונקציות בשילוב עם מספר מrepressors translational ומפעילי²⁸. בעוד FBF-2 ו-GLD-1 מבוטאים בתאי הגזע ואזורי pachytene, בהתאמה, OMA-1 היא ביטוי בדרך מאוד מתבטאת ב-germline מתוך pachytene meiotic באמצעות האוציטים²⁷ (איור 1). הדבר מרמז על כך DLC-1 צורות מתחמים עם RBPs באזורים שונים של gonad. יש גם נמצא כי האינטראקציה הישירה בין DLC-1 ו-OMA אחד נצפתה בתוך מבחנה לא התאושש על ידי vivo IP. ה-PLA שימש בהצלחה כגישה חלופית למחקר נוסף זה אינטראקציה ב -C. אלגיה germline, ואת התוצאות מרמזות כי PLA ניתן להשתמש כדי לחקור ppis רבים אחרים בתולעת.