단백질의 80% 이상은 세포^2에있는 특정 생물학 기능의 실행에 PPI가 얼마나 중요한지 강조하는 그밖 분자^1와상호 작용이 있기 위하여 추정됩니다. 몇몇 단백질은 세포 생존을 위해 필요한 더 큰 복합물의 집합을 촉진하는 허브로^{작동합니다 1.} 이 허브는 다중 PPI를 중재하고 세포^3에있는 특정 기능을 용이하게 하는 네트워크로 단백질을 구성하는 것을 돕습니다. 단백질 복합체의 형성은 또한 특정 상호 작용하는 파트너의 존재 또는 부재와 같은 생물학적 맥락에 의해 영향을 받습니다^4,세포 신호 이벤트, 및 세포의 발달 단계.

C. 예쁜꼬마선충은 일반적으로 발달을 포함한 다양한 연구를 위한 모델 유기체로서 사용된다. 이 동물의 간단한 해부학은 고나드, 창자 및 투명 표피를 포함한 여러 장기로 구성되어 있어 웜 발달 분석을 용이하게합니다. gonad에 있는 생식선은 배아로 발전하고 결국 자손의 다음 세대로 발전하는 gametes^5로 어떻게 생식선 줄기 세포가 성숙하는지 공부하는 중대한 공구입니다. 생식선의 말단 팁 영역은 자가 갱신 줄기 세포의 풀을 포함합니다(그림 1). 줄기 세포가 틈새 시장을 떠날 때, 그들은 meiotic pachytene로 진행하고 결국 젊은 성인 단계에서 oocytes로 발전합니다(그림 1). 생식선에서의 이러한 발달 프로그램은 RNA 결합 단백질(RBPs)에 의해 촉진된 전사 후 조절 네트워크를 포함하는 상이한 메커니즘을 통해 엄격하게 조절된다^6. PP는 RBP가 다른 보조 인자와 연결하여 기능을 발휘하기 때문에 이러한 규제 활동에 중요합니다.

웜에서 PPI를 검색하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있지만 각 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 생체 내 면역 침전 (IP)은 전체 웜 추출물에서 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 웜에서 PPI가 발생하는 위치를 나타내지 않습니다. 또한, 단백질 복합체는 특정 발달 단계 또는 제한된 수의 세포에서 일시적이며 단지 형성되는 단백질 복합체는 공동 면역 침전에 의해 회복되기 어려울 수 있다. 마지막으로, IP 실험은 친화성 매트릭스상에서 단백질의 용해 및 비특이적 보존 후 단백질 복합 재분류에 대한 우려를 해결해야 합니다.

PPI의 구내 검출에 대한 대안적 접근법은 공동 면역 염색, Förster 공명 에너지 전달(FRET), 및 이중 분자 형광 보완(BiFC)이다. 공동 면역 염색은 고정 된 웜 조직에서 관심있는 두 단백질의 동시 검출및 신호 동국화 의 정도 측정에 의존합니다. 표준 현미경 검사법^7보다더 자세한 정보를 제공하는 초고해상도 현미경 검사법을 사용하면 200-300 nm^8의회절 제한 장벽을 넘어 단백질 공동 국소화를 보다 엄격하게 테스트하는 데 도움이됩니다. 그러나, 기존의 및 초고해상도 현미경 검사법을 모두 사용하는 공동 면역 염색은 잘 정의된 국소화 패턴을 가진 단백질에 가장 적합합니다. 반대로 분산된 상호 작용 파트너에게는 훨씬 덜 유익합니다. 중첩에 기초한 신호의 공동 국소화를 위한 측정은 단백질이 서로 복잡한지 에 대한 정확한 정보를 제공하지 않습니다^9,,10.

더욱이, 단백질 단백질 복합체의 공동 면역 침전 및 공동 면역 염색은 양이 아니므로 그러한 상호 작용이 중요한지 결정하기가 어렵습니다. FRET와 BiFC는 모두 형광 기반 기술입니다. FRET는 하나의 FP(공여자)로부터의 에너지가 다른^{FP(acceptor)(acceptor)(acceptor)(11)로}이송되는 스펙트럼 이중되는 형광 단백질(FPs)을 가진 관심 단백질의 태그 지정에 의존한다. 이러한 비방사성 에너지 전달은 각각의 방출 파장에서 검출될 수 있는 수용기 FP의 형광을 초래한다. BiFC는 생체 내 형광 단백질의 재구성을기반으로합니다. 그것은 두 개의 상보적인 단편으로 GFP를 분할 수반, 나선 등 1-10 그리고 나선 11^12,다음 관심의 두 단백질에 융합. 이 두 단백질이 상호 작용하는 경우에, GFP의 상보적인 단편은 GFP 불소를 재구성하는 접고 집합하기에 충분히 가깝게 됩니다. 재구성된 GFP는 형광으로 직접 관찰되고 PPI가 발생한 위치를 나타냅니다.

따라서, FRET와 BiFC 둘 다 태그된 단백질의 기능을 방해할 수 있는 큰 형광 태그에 의존합니다. 또한, FRET 및 BiFC는 정확한 데이터를 얻기 위해 태그가 지정된 단백질의 풍부하고 유사한 발현을 필요로 한다. FRET는 한 파트너가 다른 파트너를 초과하는 실험에 적합하지 않을 수 있으며, 이는 높은 배경^13으로이어질 수 있습니다. BiFC 실험에서과발현은 배경이 증가하는 비특이적^{어셈블리(14)를} 유도할 수 있기 때문에 피해야 한다. 두 기술 모두 태그가 지정된 단백질의 발현 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 하며, 이는 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 연장할 수 있습니다.

근접 결찰 분석법(PLA)은 위에서 언급한 기술의 한계를 해결할 수 있는 대안적인 접근법이다. PLA는 관심 있는 단백질(또는 그들의 꼬리표)을 인식하는 1차 항체를 이용한다. 이들 1차 항체는 40 nm(또는 더 짧은) 거리¹⁵내에 있을 때 서로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 이차 항체에 의해 결합된다. 생성된 혼성화된 DNA는 DNA를 보완하는 프로브에 의해 검출되는 PCR 반응을 통해 증폭됩니다. 이것은 현미경에 의해 구상되는 초점에서 유래합니다. 이 기술은 복잡한 조직 (즉, 웜 고나드)에서 현장에서 PPI를 감지 할 수 있으며, 이는 다양한 개발 및 분화 단계에서 세포를 포함하는 조립 라인으로 구성됩니다. PLA를 사용하면 PPI가 고정 된 웜 고나드에서 직접 시각화 될 수 있으며, 이는 특정 개발 단계에서 PPI가 발생하는지 여부를 조사하는 데 유리합니다. PLA는 정확한 측정에 이상적인 공동 현지화 기반 분석에 반대되는 PPI의 더 큰 분해능을 제공합니다. 사용 하는 경우, 초고해상도 현미경 세포 내에서 PLA 초점의 위치에 대 한 더 미세한 세부 정보를 제공할 가능성이 있다. 또 다른 장점은 PLA 반응으로 인한 초점을 ImageJ 기반 분석 워크플로우에 의해 계산할 수 있어 이 기술을 정량적으로 만들 수 있다는 것입니다.

다인 경쇠의 LC8 제품군은 먼저 다인 모터 컴플렉스^16의 소단위로 설명되었고 화물 어댑터역할을 하도록 가설되었다. 초기 발견 이후, LC8은 다인 모터 복합체 이외에 다중 단백질 복합체에서 발견되었으며^{17,,18,,19,,20.} LC8 상호작용^{모티프(19)를} 포함하는 단백질 서열을 스캐닝하는 것은 LC8이 다양한 단백질^{17,18,,19,,20,,21,,22와}많은 상호작용을 가질 수 있음을 시사한다.^, 그 결과, LC8 패밀리 단백질은 이제 본질적으로 무질서한 단백질^21의조립체와 같은 더 큰 단백질 복합체^19,,22의조립을 촉진하는 데 도움이 되는 허브로 간주된다.

하나의 C. elegans LC8 패밀리 단백질, 다인 경막-1(DLC-1)은 많은 조직에 걸쳐 널리 발현되며 특정 세포내^{구조(23,,24)에서}농축되지 않는다. 따라서, C. 예쁜꼬마선충에서 DLC-1의 생체 내 파트너의 생물학적으로 관련성이 있는 식별은 여러 가지 이유로 도전적입니다: 1) 공동 면역 침전은 상호작용이 발생하는 조직 공급원을 나타내지 않는다; 2) 특정 파트너 또는 일시적인 상호 작용의 제한된 발현은 공동 면역 침전에 의한 상호작용을 검출하는 능력을 방해할 수 있다; 및 3) DLC-1의 확산 분포는 공동 면역 염색에 의해 잠재적인 파트너 단백질과 비특이적 중첩을 유도한다. 이러한 과제를 바탕으로 PLA는 DLC-1과의 생체 내 상호 작용을 테스트하기 위한 이상적인 접근 방식입니다.

이전에는 DLC-1이 RNA 결합 단백질(RBPs) FBF-2²³ 및 GLD-1^25와직접 상호 작용하고 보조 인자역할을 한다는 것이 보고되었다. 우리의 일은 허브 단백질로 봉사하는 DLC-1의 모형을 지원하고 DLC-1이 dynein^19,,22를넘어 서 상호 작용 네트워크를 용이하게 한다는 것을 건의합니다. GST 풀다운 분석을 사용하여 OMA-1이라는 새로운 DLC-1 상호 작용 RBP가^26으로확인되었습니다. OMA-1은 난모세포 성장 및 meiotic^{성숙(27)과} 다수의 번역억제기 및^{활성제(28)와}함께 기능하는 데 중요하다. FBF-2 및 GLD-1은 줄기 세포 및 메오틱 파키텐 영역에서 각각 발현되는 반면, OMA-1은 난모세포^27(도 1)을통해 메오틱 파키텐으로부터 생식선으로 확산발된다.1.1. 이것은 DLC-1이 고나드의 다른 지역에 있는 RP를 가진 복합체를 형성한다는 것을 건의합니다. 또한 시험관 내에서 관찰된 DLC-1과 OMA-1 사이의 직접적인 상호작용이 생체 내 IP에 의해 회복되지 않는다는 것이 밝혀졌다. PLA는 C. elegans 생식선에서 이 상호 작용을 추가로 연구하기 위한 대체 접근법으로 성공적으로 사용되었으며, 결과는 PLA가 웜의 다른 많은 PPI를 조사하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.