JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

שימוש בביופסיה כימית להערכת איכות השתל

Published: June 17, 2020
doi:
10.3791/60946
, , , , , , , , ,
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy,Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery,Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz,Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine,Toronto General Hospital

Summary

הפרוטוקול מציג ניצול של הגישה הביופסיה הכימית ואחריו ניתוח מטבולומי וליפידומי מקיף להערכת איכות של שתלי כליות שהוקצו להשתלה.

Abstract

השתלת כליה היא טיפול מציל חיים עבור מספר גדול של אנשים עם תפקוד לקוי של כליות בשלב הסופי ברחבי העולם. ההליך קשור שיעור הישרדות מוגבר ואיכות גבוהה יותר של חייו של המטופל בהשוואה לדיאליזה קונבנציונלית. למרבה הצער, השתלות סובלות מחוסר שיטות אמינות להערכת איכות איברים. טכניקות אבחון סטנדרטיות מוגבלות לבדיקת מראה מאקרוסקופי או ביופסיה פולשנית של רקמות, שאינן מספקות מידע מקיף על השתל. הפרוטוקול המוצע נועד להציג מיקרו-extraction שלב מוצק (SPME) כשיטה אנליטית אידיאלית עבור מטבולומיקה מקיפה וניתוח ליפידמי של כל התרכובות המולקולריות הנמוכות הנוכחיות בכליות שהוקצו להשתלה. הגודל הקטן של הגשוש SPME מאפשר ביצועים של ביופסיה כימית, המאפשרת חילוץ של מטבוליטים ישירות מהאיבר ללא כל איסוף רקמות. הפולשניות המינימלית של השיטה מאפשרת ביצוע של מספר ניתוחים לאורך זמן: מיד לאחר קצירת איברים, במהלך שימורה, ומיד לאחר ההתרה מחדש בגוף המטופל. הוא שיער כי השילוב של שיטת דגימה רומן זה עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה יאפשר אפליה של קבוצה של תרכובות אופייניות שיכול לשמש סמנים ביולוגיים של איכות שתל ואינדיקטורים של התפתחות אפשרית של תפקוד לקוי של איברים.

Introduction

לפי רשת רכש האיברים וההשתלות של ארה”ב, ב-2019 היו 94,756 חולים שחיכו להשתלת כליה בארה”ב; בעוד באירופה ב-2018 המספר הזה היה 10,791. כל עשר דקות, מישהו מתווסף לרשימת ההמתנה הלאומית להשתלה בארה”ב, וההערכה היא כי 20 אנשים מתים בכל יוםבהמתנה להשתלה 1,,2. השתלת כליה היא טיפול מציל חיים עבור מספר גדול של אנשים הסובלים מתפקוד לקוי של כליות בשלב הסופי ברחבי העולם. ההליך מזוהה עם שיעור הישרדות מוגבר ואיכות חיים גבוהה יותר בהשוואה לדיאליזה קונבנציונלית.

עם זאת, השתלה מתמודדת עם בעיות חמורות רבות, כגון מחסור באיברים או היעדר כלים יעילים להערכת איכות איברים. הפרוטוקולים הסטנדרטיים מוגבלים לבדיקת מראה מאקרוסקופי או לביופסיה פולשנית של רקמות, שאינן מספקות מידע מקיף בנוגע לאיכות השתל. בעוד הערכות חזותיות מאפשר זיהוי של גידולים גלויים לעין, חריגות אנטומיות, או נזק נרחב לשתלים, גישה זו היא סובייקטיבית מאוד, משתנה ביעילותה על פי הניסיון של הצופים. ביופסיה, לעומת זאת, יכולה לספק מידע רב ערך בנוגע להפרעות כליות קיימות מראש, ולכן נחשבת לשיטה של ערך אובייקטיבי ומובע בקביעת תוצאות השתל. עם זאת, הליך הביופסיה אינו חופשי מפגמים; נכון לכך, נכון לסיבוכים פוטנציאליים כגון דימום ו-4-5 שעות נוספות של הכנת מדגם, מה שמאריך משמעותית את זמן האיסכמי הקר. לכן, במיוחד באירופה, השימוש בניתוח רקמות ישיר מוגבל לתורמים קריטריונים מורחבים (ECD) ותורמים לאחר מוות במחזור הדם (DCD)3,,4.

מטבולומיקה וליפידומיקה הוכרו לאחרונה כגישות מבטיחות להשגת הבנה טובה יותר של השינויים במסלולים ביוכימיים המתרחשים במהלך שימור איברים. פרופיל מטבולומי וליפידומי מאפשר ניטור של תגובות מיידיות של המערכת לשינויים סביבתיים פתאומיים הקשורים להסרת איברים עם ההשלכות הבאות: איסכמיה, סטרס חמצוני, או תגובותדלקתיות 5,6,7,8. הכליה היא איבר הקשור במידה רבה עם תהליכים מטבוליים, ולכן מדידות של מטבוליטים וריכוזי שומנים עשויים לאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים באיכות איברים פוטנציאליים ולאפשר תחזיות טובות יותר של תוצאת השתל.

בהתחשב בסיבוכים ובמגבלות הנ”ל הקשורים לשיטות הערכת איכות האיברים הנוכחיות, נדרש פתרון אבחון פחות פולשני להערכת איכות איברים מהירה ומורכבת. מיקרו-extraction שלב מוצק (SPME) עומד בדרישות אלה כשיטה אנליטית פולשנית המאפשרת כיסוי של קשת רחבה של מטבוליטים ושומנים. הטכניקה מבוססת על החדרה של דק (~ 200 μm), תואם ביולוגית, טיטניום ניקל סגסוגת בדיקה מכוסה עם שלב חילוץ סלקטיבי לתוך האיבר שנבדק לזמן קצר. יש להדגיש כי SPME מונעת הפקת חלבון, ולכן מאפשרת עיכוב חילוף החומרים כבר בשלב של איסוף מדגם, שהוא יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות. יתר על כן, מזעור המכשיר מאפשר ביצוע של ניתוחים חוזרים בו זמנית של מבנים מעטים שלהאיבר 9,10,11.

Protocol

כל בעלי החיים קיבלו טיפול הוומני בהתאם ל’עקרונות הטיפול בבעלי חיים במעבדה’, שנוסחו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי ו’המדריך לטיפול בחיות מעבדה’, שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות, אונטריו, קנדה. ועדת הטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר הכללי של טורונטו אישרה את כל המחקרים. המחקר כלל נושאים אנושיים אושר על ידי הוועדה הביואתית בקולגיום מדיקום באוניברסיטת בידגוז’ץ’ ניקולאוס קופרניקוס בטוריון. הערה: קבל אישור מלוחות אתיים מתאימים. זכור תמיד ללבוש כפפות בטיחות. אל תיגע בשלב החילוץ של בדיקות SPME. השימוש בקבוקונים זכוכית מנוטרלים מומלץ לניתוחים ליפידומיים. 1. הכנת גששים הכן בדיקות סגסוגת טיטניום ניקל (אורך 40 מ”מ; קוטר 0.2 מ”מ) מצופה סורבנט במצב ערבוב של 7 מ”מ. מספר הבדיקות תלוי בנקודות הזמן המיועדות במהלך ההליך כולו ובמספר השכפולים (3 מומלץ לכל נקודת זמן).הערה: ניתן להתאים את האורך והסוג של שלב החילוץ בהתבסס על מצב המחקר, הקוטביות של מטבוליטים ומטריצת הדגימה. להכין תערובת ניקוי המורכבת 2:1 כלורופורם:מתנול (v /v). Pipet 1.0 מ”ל של הפתרון לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ”ל ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון.הערה: לפני השימוש, נקה את כל הגששים כדי להסיר חלקיקים מזהמים. שים את הבקבוקונים על המסית וקבעו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל”ד. לאחר 45 דקות, הפסק את ההתקן ושטוף את הציפויים במים באיכות LC-MS. כמו ציפויים חייבים לעבור שלב תנאי מראש כדי להפעיל אותם, להכין תערובת תנאי מראש מורכב 1:1 מתנול:מים (v / v). Pipet 1.0 מ”ל של הפתרון לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ”ל ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון. שים את הבקבוקונים על מסית המערבולת וקבעו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל”ד. לאחר 60 דקות, עצרו את המסית ושטו את הציפויים במים באיכות LC-MS. לחטא גששים על פי פרוטוקול עיקור ציוד כירורגי סטנדרטי. 2. חילוץ פתח את החבילה הסטרילית ממש לפני הדגימה כדי להבטיח סביבה סטרילית. הכנס שתי בדיקות ישירות לתוך קליפת הכליה במשך 10 דקות בכל נקודת זמן. כל אורך הציפוי חייב להיות מכוסה על ידי מטריצת הרקמות; אין צורך בזווית ספציפית, אך בדרך כלל נעשה שימוש ב- 90 deg.הערה: ההליך הרפואי כולו פועל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים במוסד נתון. לא נשקל שינוי בנוגע לדגימת SPME. ההליך כולל את שש נקודות זמן הדגימה הבאות:א) לפני ניתוח כליה, ב-vivo מהתורם;ב)-ה) לאחר שעה אחת, 3 שעות, 5 שעות, 7 שעות של עירוי כליה, אקס ויו בתא איברים;ו) לאחר התברה מחדש, ב vivo מן הנמען. משוך את הגששים על ידי משיכתו מהרקמות ולאחר מכן לשטוף ציפויים עם מים כיתה LC-MS כדי לנקות את כל הדם שנותר מפני השטח ציפוי. לשטוף הרחק מהאתר הכירורגי, ומיד לאחר הסרת הגששים. 3. תחבורה ואחסון מניחים גששים בקבוקונים נפרדים וסוגרים אותם. מניחים בקבוקונים בקופסת קלקר מלאה בקרח יבש או בחנקן נוזלי להובלה. אחסן דגימות במקפיא (-80°C), או החל באופן מיידי בשלב ההסתה. 4. דסת-ספיגה הכן פתרונות desorption מורכב 80:20 acetonitrile:water (v/v) לניתוח מטבולומי, ו 1:1 isopropanol:מתנול (v / v) לניתוח ליפידומי. Pipet 100 μL של הפתרון להכנסות ממוקם לתוך בקבוקונים 2.0 מ”ל מסומן ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון. מניחים את הבקבוקונים על מסית המערבולת והגדירו את מהירות התסיסה על 1,200 סל”ד למשך 120 דקות. הסר גששים מהתנונים. תמציות שהושגו מוכנות כעת לניתוח אינסטרומנטלי. 5. ניתוח LC-MS מקם בקבוקונים המכילים תמציות בהמסאמפלר האוטומטי של מערכת LC-MS.הערה: כרומטוגרפיה נוזלית (RP, HILIC) יחד עם ספקטרומטריה מסה ברזולוציה גבוהה ומנתח מסה orbitrap שימשו למחקר זה. לקבלת פרמטרים של ניתוח מטבולומי, עבור לשלב 5.2. לקבלת פרמטרים לניתוח ליפידומי, עבור לשלב 5.6. השתמש בעמודת pentafluorophenyl (PFP) (2.1 מ”מ x 100 מ”מ, 3 μm) להפרדת פאזה הפוכה. הגדר את קצב הזרימה ל- 300 μL/min, וטמפרטורות של שאמפלר אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 25°C, בהתאמה. הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב א’ נייד: מים:חומצה פרמית (99.9:0.1, v/v) ושלב ב’ נייד: חומצה אצטוניטרית:חומצה פרמית (99.9:0.1, v/v). הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: התחלת זרימת שלב נייד (0-3 דקות): 100% A ואחריו מעבר צבע ליניארי ל- 10% A (3-25 דקות), סיום עם זרימה איסטוקרטית של 10% A עד 34 דקות, ולאחר מכן 6 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודה. להפרדת HILIC, השתמש בעמודה HILIC (2.0 מ”מ x 100 מ”מ, 3 μm, 200A). הגדר את קצב הזרימה ל- 400 μL/min. הכנת שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב א’: אצטוניטריל:אמניום אצטט מאגר (9:1, v/v, ריכוז מלח יעיל 20 מ”מ), נייד שלב ב’: אצטוניטריל:אמניום אצטט מאגר (1:1, v/v, ריכוז מלח יעיל 20 מ”ר). הגדר את זרימת שלב הנייד בהתאם לפרמטרים הבאים: הפעלת זרימת שלב נייד (0-3 דקות) ב- 100% A, החזק למשך 3.0 דקות ולאחר מכן רמפה ל- 100% B בתוך 5 דקות. החזק עם 100% B עד 12 דקות, ואחריו 8 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודה. הגדר את טווח הסריקה ל- 85-1000 מ”ל/z. הגדר את פרמטרי מקור היונים HESI במצב ניוון חיובי ל: מתח ספריי 1,500 V, טמפרטורת נימי 300 °C, גז נדן 40 a.u., aux גז זרימת קצב 15 a.u., טמפרטורת דוד בדיקה 300 °C, S-עדשה RF רמה 55%. הפעל דגימות QC המורכבות מ-10 μL של כל מדגם מנותח (באופן קבוע, כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר. להפרדת פאזה הפוכה, השתמש בעמודת C18 (2.1 מ”מ x 75 מ”מ, 3.5 μm). הגדר את קצב הזרימה ל- 200 μL/min, וטמפרטורות של שאמפלר אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 55°C, בהתאמה. הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב A נייד: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM אמוניום אצטט וחומצה אצטית 1 mM; נייד שלב ב’: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM אמוניום אצטט ו 1 mM חומצה אצטית. הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: 0-1 דקות (20% B), 1-1.5 דקות (20-50% B), 1.5-7.5 דקות (50-70% B), 7.5 דקות 5-13 דקות (70-95% B), 13-17 דקות (95% B), 17-17.1 דקות (95-20% B), 17.1-23 דקות (20%). עבור הפרדת HILIC, השתמש בעמודת HILIC (100 x 2.1 מ”מ, 3 μm). הגדר את קצב הזרימה ל- 400 μL/min, וטמפרטורות של מדל אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 40°C, בהתאמה. הכן שלבים ניידים בהתאם לפרופורציות הבאות: שלב A: ACN נייד; נייד שלב ב’: 5 mM אמוניום אצטט במים. הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: 0-2 דקות (96% B), 2-15 דקות (96-80% B), 15-15.1 דקות (80-96% B), 15.1-21 דקות (96% B). הגדר פרמטרים מקור יון HESI במצב ניוון חיובי לרסס מתח 3,500 V, טמפרטורת נימי 275 °C, גז נדן 20 a.u., קצב זרימת גז aux 10 a.u., טמפרטורת דוד בדיקה 300 °C, S-עדשה RF רמה 55%. הפעל דגימות QC המורכבות מ-10 μL של כל מדגם מנותח (כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר. בצע רכישת נתונים בתוכנה התואמת לכלי. 6. ניתוח נתונים בצע עיבוד נתונים, זיהוי putative, וניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה המוקדשת מטבולומיקה לא מנוי וניתוח lipidomics.הערה: ניתן להשיג ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ומזימות שפם קופסאות כדי להמחות את מבנה הנתונים.

Representative Results

איסוף לדוגמה בוצע על פי שיטת SPME המתוארת לעיל, באמצעות בדיקות מצופה בשלב חילוץ 7 מ”מ במצב מעורב. הדגימה נערכה ישירות מרקמות השתל (ב vivo לפני ההשתלה), ex vivo בתא כליות לאחר 1 שעות, 3 שעות, 5 שעות, ו 7 שעות של עירוי, ו ב vivo לאחר revascularization במקבל. ניתוחים מטבולומיים וליפידומיים לא מרוסקים בוצעו עם שימוש כרומטוגרפיה נוזלית (RP, HILIC) יחד עם ספקטרומטריה מסה ברזולוציה גבוהה, עם מנתח המסה להגדיר במצב יוניזציה חיובית. כדי להעריך את איכות הנתונים ולהשיג תובנות כלליות לגבי התוצאות, הנתונים היו נתונים לניתוח רכיבים עיקריים (PCA). כפי שמצג באות 1, דגימות QC יצרו אשכול הדוק, המאשר את איכות הניתוחים. הקבוצות הנחקרות מציגות הפרדה טובה יחסית, המאפשרת הדמיה של הבדלים בפרופילים מטבוליים וליפידמיים לפני ואחרי ההשתלה, כמו גם במהלך עירויאיברים (איור 2). דגימת SPME מאפשרת פרופיל חילוף חומרים של האיבר לאורך זמן. חלקות שפם תיבת של מטבוליטים נבחרים משמשים כדי להדגים שינויים ברמות מטבוליט לאורך כל הניסוי (איור 3). הספקטרום הרחב של תכונות שחולצו המופרדות הן בעמודות RP והן בעמודות HILIC מוצג באיון 4. איור 1: ניתוח רכיבים עיקריים המציג קיבוץ באשכולות של דגימות בקרת איכות עבור ניתוחים של שלב מטבולומי הפוך (A), HILIC (B) וליפידומי הפוך-שלב (C), HILIC (D). בקרת האיכות נחוצה בניתוח לא מיואף כדי לעקוב אחר כל שינוי אפשרי הנגרם על ידי חוסר יציבות אינסטרומנטלית. אשכול הדוק של דגימות QC מבטיח כי כל השינויים שנצפו הם ממוצא ביולוגי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: ניתוח רכיבים עיקריים המציג הבדלים מטבולומיים (A) ולפידומי (B) בין נקודות דגימה מסוימות. פרופיל לא מפולצ של כליה עם SPME-LC-HRMS מאפשר לבחון הבדלים ביוכימיים באיברים בשלבים הבאים של שימורם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: חלקות של תרכובות נבחרות המציגות שינויים במטבוליטים (A, B) ושומנים (C, D) במהלך תקופת ההשתילה. לאחר בחירה וזיהוי של תרכובות מפלות תיבת-שפם חלקות מאפשר לעקוב אחר שינויים ברמות של תרכובות אלה בשלבים הבאים של הפרוטוקול ולהשוות את רמות מטבוליטים באיברים נתון פרוטוקולי שימור שונים או נקטפו מתורמים שונים למשל לב פועם תורמים או תורמים לאחר מוות לב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: מפת יון (m/z לעומת זמן שמירה) של תכונות שהושגו על-ידי ניתוח LC-MS עם (A) הפרדת HILIC הפוכה ו- (ב). העלילה מאפשרת להעריך את המספר הכולל של תכונות שהושגו עם הפרוטוקול המוצע (מחילוץ לזיהוי) ולהעריך כיסוי אנליטי בהתבסס על הקוטביות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הערכת איכות האיברים נותרה אתגר גדול עבור רופאים, שחייבים לקבל החלטות מושכלות מהירות לגבי האם איבר נתון הוא בר קיימא להשתלה או אם יש להשליך אותו. גורמים רבים, כגון גיל התורם, משך האיסכמיה, זיהומים ותהליכים דלקתיים, יכולים להשפיע על התוצאה השתל לטווח ארוך. בעוד שיטות מגוונות פותחו עד כה כדי לאבחן תפקוד allograft כליה, בדיקה היסטופתולוגית נשאר תקן הזהבבעניין זה 3,,4,,12. למרות הליך הביופסיה יכול להניב מידע משמעותי לגבי מחלת תורם קיימת מראש ושינויים בכלי הדם, זה לא ללא פגמים. שגיאות דגימה הקשורות השתנות interobserver ותמדה של glomeruli מספיק למידע מקיף לגבי תפקוד איברים להישאר חששות אופייניים בהקשר זה. יתר על כן, הכנת דגימה מביאה כמה בעיות כגון אודם לא שלם של השתל במקרה של חלקים קפואים, והארכת זמן הליך עבור פרפין קטעים. עם זאת, הסיכון המוגבר לדימום, אשר עשוי להיראות באופן חריף כמו hematuria מיקרוסקופי או ברוטו, הוא הסיבוך מסכן חיים העיקרי הקשורים הליך הביופסיה. מסיבה זו, מספר הביופסיות הניתנות מוגבל אך ורק בהליכי השתלה, גורם הפוגע בלכידת שינויים דינמיים וניתוחי סדרות זמןבשיטה זו 12,13,14. היתרונות של ניתוח היסטולוגי יש לשקול נגד הסיכונים הקשורים המתודולוגיה. הערך של ממצאים היסטולוגיים הוא ללא עוררין, אבל הם לא מסבירים את המנגנונים המולקולריים של ההתפכחות.

מטבולומיקה וליפידומיקה הם התחומים הצעירים ביותר של המשפחה המדעית “-omics”. הסט המלא של מטבוליטים ושומנים אנושיים מולקולריים נמוכים (<1,200 Da) ושומנים המחוברים בתוך רשת מטבולית מוגדר כמטבולום אנושי. הגנום נשאר קבוע יחסית לאורך כל חייו, עם שינויים קלים הנגרמים על ידי מוטציות המתרחשות לעתים רחוקות. חילוף החומרים הוא תוצר של ביטוי גנים, אשר רגיש מאוד לשינויים בכל התהליכים הביולוגיים, כמו גם גורמים סביבתיים. האופי הדינמי של מטבוליטים ושומנים הופך אותם אינדיקטורים מושלמים שלמצב איבר הנוכחי 7,,8,,15,,16. שיטת SPME המוצעת בפרוטוקול הנ”ל מאפשרת זיהוי של שינויים המתרחשים באיבר במהלך שימורו, החל מהסרת איברים מגופו של התורם ועד לשיפוץ אצל המטופל. הקוטר הקטן של הגשוש (~ 200 μm) מספק פולשניות מינימלית ומאפשר מספר דגימות מאותו איבר מבלי לגרום נזק לרקמות. ביצוע מחקרים באמצעות כליה, כמו האיבר המושתל בתדירות הגבוהה ביותר, מאפשר הבנה טובה יותר ואפיון נוסף של המסלולים חילוף החומרים האחראים לירידה באיכות ותפקוד של שתלים. האפשרות של ניטור שינויים לאורך זמן בהחלט הוא יתרון חשוב של הטכניקה לעומת שיטות פולשניות קונבנציונליות כגון ביופסיה. הניתוח שהוצג כעת זיהה ריכוזים משתנים של קבוצות שונות של שומנים ומטבוליטים, במיוחד של חומצות אמינו חיוניות, purines, נוקלאוזידים purine, ו גליצרופוספוליפידים. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם דוחות ניתוחרקמות קודמים 5,6,17,18,19,20. עד כה, רוב הדיווחים המדעיים ניצול מטבולומיקה או lipidomics כדי להסביר תהליכים המביאים סיבוכים לאחר השתלה או איסכמיה / פגיעה reperfusion (IRI) תופעות הוגבלו לניתוח של נוזליםביולוגיים 21,22,23.

כל יישום קליני דורש אופטימיזציה של פרוטוקול הדגימה כדי להבטיח שביצועי השיטה האנליטית עומדים בקריטריונים הצפויים. בהקשר זה, היתרון של ניצול SPME היא האפשרות של התאמת תנאים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. מגוון שלבי החילוץ הנגישים מספק קשת רחבה של מטבוליטים שחולצו עם קוטביות מגוונת. במקביל, הדבר עשוי להיחשב כמגבלה של השיטה בשל העובדה שכל סורבנט מספק תסכולת כלפי תכונות ספציפיות ואינו לחלץ את כל התרכובות הנוכחיות במטריצת הדגימה. יש לצוין כי ציפויי SPME לחלץ רק באמצעות מולקולות חינם, ופשוט לא אינטראקציה עם שבר מאוגד של analyte. תאימות ביולוגית של הציפויים אינה מציגה רעילות לרקמה תוך ריסון החילוץ של מולקולות גדולות כגון חלבונים; כתוצאה מכך, התהליכים האנזימטיים מעוכבים כבר בשלב של איסוף מדגם והנוכחות של חפצים ממוזערת, וזה יתרון גדול על פני שיטות דגימה חלופיות. אורך הציפוי משפיע על יעילות החילוץ (כלומר, אורך הציפוי מייעד את שטח הפנים ואת נפח שלב החילוץ); לכן, ציפויים ארוכים יותר מניבים התאוששות גבוהה יותר. מצד שני, ציפויים קצרים יותר מאפשרים רזולוציה מרחבית גבוהה יותר. לקבלת תוצאות אמינות, זה חיוני להשיג את הגשוש בדיוק באותו עומק של קליפת הכליה. הכנסה עמוקה מדי גורמת לסיכון של כניסה מדיולה הכליה. זמן החילוץ הוא גם פרופורציונלי ליעילות החילוץ. לכן, בחירת זמן חילוץ אופטימלי הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפיתוח שיטת SPME. הדיוק של מדידת הזמן מספק את יכולת החזור הגבוהה ביותר. ביישומים ביולוגיים כמו זה שנדון, תמיד קיימת פשרה בין הרגישות והחזרה של הפרוטוקול האנליטי לבין ההגבלות של ההליך הרפואי. בעוד חילוץ שיווי משקל מספק את הרגישות הגבוהה ביותר, מטעמי בטיחות, תנאים טרום שיווי משקל משמשים לעתים קרובות ביישומים כאלה, כמו זמן החילוץ לא צריך להשפיע על משך הזמן הכולל של הניתוח. יעילות ההסתננות נקבעת לפי זמן התהליך והרכב ממס ההסתה, שאמור להיות תואם לשלב הנייד המשמש להפרדהכרומטוגרפית 9,,10,,11.

אחת הדרישות העיקריות עבור מכשור אבחון המשמש להערכות פנים כירורגיות היא זמן הניתוח. הניסיונות הנוכחיים נעשות לפתח כלי מהיר עבור חילוץ VIVO SPME בשילוב ישיר ספקטרומטר מסה באמצעות ממשק פתוח מיקרופלויד (MOI)24 או ספריי להב מצופה (CBS)25. גישות כאלה יאפשרו גילוי של תוצאות אנליטיות בזמן אמת או קרוב לזמן אמת. השימוש בשיטות כאלה לניתוחי התערבות מוקדמת של פרופילים מטבוליים וליפידומיים יכול לשפר את תהליך קבלת ההחלטות במהלך הליכי ההשתלה, ולאפשר את הגישה המותאמת אישית הטובה ביותר האפשרית ותגובה מהירה במקרה של כשל איברים.

כסיכום, הוא שיער כי הפרוטוקול המוצע יאפשר השגת פרופילים מטבוליים וליפידומיים מלאים של שתלי כליות, אשר בתורו יספק הערכה מקיפה של איכות האיברים ואפיון של התהליכים האחראים על פגיעה איסכמיה-reperfusion. החידוש של הפרויקט כולל ניצול של מיקרו-אקסטרציה בשלב מוצק (SPME), המציע דגימה פולשנית נמוכה של מערכות חיים, בשילוב עם אחת הטכנולוגיות החדשניות ביותר הזמינות לניתוח מטבולומיקה ולליפידומיקה (לדוגמה, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה Orbitrap). SPME משלב איסוף דגימה, חילוץ, והתרוות של מטבוליטים בשלב אחד, ולכן מה שהופך אותו לכלי מושלם לניתוח מהיר. זה צפוי כי פרוטוקול זה יעזור לענות על שאלות הקשורות אילו תנאי טרום השתלה של הכליה אחראים לתפקוד איברים מושהה או תפקוד לקוי שלה לאחר ההשתלה, כמו גם איך פרוטוקול שימור השתל משפיע על הביוכימיה של האיבר. ידע כזה לא רק תהיה השפעה משמעותית על מניעת סיבוכים אפשריים הקשורים להשתלה, אבל עשוי לעזור לשפר את פרוטוקולי שימור השתל הנוכחי, מזעור אובדן של רקמת השתלה בת קיימא, כמו גם אובדן חיים. הפתרון המוצע יפתח את הדלת לחקירות נוספות בתחום זה, לרבות אימות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ספציפיים ושיפור התוצאות הטיפוליות בהשתלות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי מענק אופוס UMO-2017/27/B/NZ5/01013 ממרכז המדע הלאומי. המחברים רוצים להכיר MilliporeSigma, עסק של Merck KGaA, דרמשטט, גרמניה לאספקת מכשירי SPME. עסקי מדעי החיים של מרק פועלים כמיליפור סיגמה בארה”ב ובקנדה. כמו כן, המחברים רוצים להודות לתרמו פישר סיינטיפיק על הגישה לספקטרומטר מסה של Q-Exactive Focus. המחברים רוצים להודות ד”ר אלכסנדרה Woderska-Jasińska ואנשי המחלקה להשתלות ו Surgery כללי ב Bydgoszcz על עזרתם האדיבבפרויקט. BB רוצה להודות לפרופ’ יאנוס פוליזמן על ההזדמנות של איסוף דגימות בבית החולים הכללי של טורונטו במהלך שהותה באוניברסיטת ווטרלו.

Materials

Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . Organ Procurement and Transplantation Network Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019)
  2. Branger, P., Undine, S. . Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research – How far are we from daily practice. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Chemical BiopsyOrgan TransplantationGraft Quality AssessmentSPME ProbesBiocompatible CoatingsTumor AnalysisPreconditioning MixtureSterilizationKidney CortexMetabolomic AnalysisLipidomic AnalysisLiquid ChromatographyMass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image