Het protocol presenteert het gebruik van de chemische biopsie aanpak gevolgd door uitgebreide metabolomic en lipidomische analyse voor de kwaliteit van de beoordeling van niertransplantaties toegewezen voor transplantatie.
Niertransplantatie is een levensreddende behandeling voor een groot aantal mensen met een eindstadium nierdisfunctie wereldwijd. De procedure wordt geassocieerd met een verhoogde overlevingskans en een grotere kwaliteit van het leven van de patiënt in vergelijking met conventionele dialyse. Helaas lijdt de transplantatieologie aan een gebrek aan betrouwbare methoden voor de beoordeling van de orgaankwaliteit. Standaard diagnostische technieken zijn beperkt tot macroscopische verschijning inspectie of invasieve weefselbiopsie, die geen uitgebreide informatie over de graft. Het voorgestelde protocol heeft tot doel vaste fasemicroextractie (SPME) in te voeren als een ideale analysemethode voor uitgebreide metabolomics en lipidomische analyse van alle laagmoleculaire verbindingen die aanwezig zijn in nieren die voor transplantatie zijn toegewezen. De kleine omvang van de SPME-sonde maakt de uitvoering van een chemische biopsie mogelijk, waardoor metabolieten rechtstreeks uit het orgaan kunnen worden verwijderd zonder dat er weefsel wordt verzameld. De minimale invasieve werking van de methode maakt het mogelijk om meerdere analyses in de loop van de tijd uit te voeren: direct na het oogsten van organen, tijdens het behoud ervan en onmiddellijk na revascularisatie op het lichaam van de ontvanger. Het wordt verondersteld dat de combinatie van deze nieuwe bemonsteringsmethode met een massaspectrometer met hoge resolutie discriminatie mogelijk zal maken van een reeks karakteristieke verbindingen die kunnen dienen als biologische markers van graftkwaliteit en indicatoren van mogelijke ontwikkeling van orgaandisfunctie.
Volgens het United States’ Organ Procurement and Transplantation Network waren er in 2019 94.756 patiënten die in de VS op niertransplantaties wachtten; in Europa in 2018 waren dat er 10.791. Elke tien minuten, iemand wordt toegevoegd aan de nationale transplantatie wachtlijst in de VS, en er wordt geschat dat 20 mensen sterven elke dag te wachten op eentransplantatie 1,2. Niertransplantatie is een levensreddende behandeling voor een groot aantal mensen die lijden aan eindstadium nierdisfunctie wereldwijd. De procedure wordt geassocieerd met een verhoogde overlevingskans en een grotere kwaliteit van leven in vergelijking met conventionele dialyse.
Transplantatie kampt echter met veel ernstige problemen, zoals een tekort aan organen of het ontbreken van effectieve instrumenten voor de beoordeling van de orgaankwaliteit. De standaardprotocollen zijn beperkt tot macroscopische verschijningsinspectie of invasieve weefselbiopsie, die geen uitgebreide informatie geven over de kwaliteit van het transplantaat. Terwijl een visuele beoordeling zorgt voor identificatie van tumoren zichtbaar voor het oog, anatomische afwijkingen, of uitgebreide schade aan de grafts, deze aanpak is zeer subjectief, variërend in de effectiviteit ervan volgens de ervaring van de waarnemers. Biopsie, aan de andere kant, kan waardevolle informatie over reeds bestaande nieraandoeningen, en wordt dus beschouwd als een methode van objectieve en bewezen waarde bij het bepalen van graft resultaten. Echter, de biopsie procedure is niet vrij van gebreken; er is het risico van mogelijke complicaties zoals bloeden en een extra 4-5 uur monstervoorbereiding is vereist, wat de koude ischemische tijd aanzienlijk verlengt. Daarom is vooral in Europa het gebruik van directe weefselanalyse beperkt tot uitgebreide criteria donoren (ECD) en donoren na het overlijden van de bloedsomloop (DCD)3,4.
Metabolomics en lipidomics zijn onlangs erkend als veelbelovende benaderingen voor het bereiken van een beter begrip van de veranderingen in biochemische trajecten die zich voordoen tijdens orgaanbehoud. Metabolomic en lipidomic profilering maakt het mogelijk om onmiddellijke reacties van het systeem op plotselinge veranderingen in het milieu in verband met orgaanverwijdering met latere gevolgen: ischemie, oxidatieve stress of ontstekingsreacties5,6,7,8. De nier is een orgaan dat grotendeels wordt geassocieerd met metabole processen, dus metingen van metabolieten en lipiden concentraties kunnen het mogelijk maken identificatie van potentiële orgaankwaliteit biomarkers en maken betere voorspellingen van graft resultaat.
Gezien de bovenstaande complicaties en beperkingen in verband met de huidige orgaankwaliteitsbeoordelingsmethoden, is een minder invasieve diagnostische oplossing nodig voor een snelle en complexe orgaankwaliteitsbeoordeling. Solid phase microextraction (SPME) voldoet aan deze eisen als een minimaal invasieve analytische methode die dekking van een breed spectrum van metabolieten en lipiden mogelijk maakt. De techniek is gebaseerd op het inbrengen van een dunne (~ 200 μm), biocompatibele, titanium-nikkel legering sonde bedekt met een selectieve extractie fase in het onderzochte orgaan voor een korte tijd. Er moet worden benadrukt dat SPME eiwitextractie voorkomt en dus al in het stadium van de monsterverzameling een metabolismeremming mogelijk maakt, wat een aanzienlijk voordeel is ten opzichte van alternatieve methoden. Bovendien maakt de miniaturisatie van het apparaat het mogelijk om repetitieve en gelijktijdige analyses uit te voeren van enkele structuren van het orgel9,10,11.
Evaluatie van de orgaankwaliteit blijft een grote uitdaging voor artsen, die snel geïnformeerde beslissingen moeten nemen over de vraag of een bepaald orgaan levensvatbaar is voor transplantatie of dat het moet worden weggegooid. Meerdere factoren, zoals donorleeftijd, duur van ischemie en infecties en ontstekingsprocessen, kunnen de uiteindelijke uitkomst van de enting op lange termijn beïnvloeden. Hoewel tot op heden diverse methoden zijn ontwikkeld om de nieraltograftfunctie te diagnosticeren, blijft histopathologische inspectie de gouden standaard in die kwestie3,4,12. Hoewel de biopsieprocedure aanzienlijke informatie kan opleveren over reeds bestaande donorziekte en vasculaire veranderingen, is het niet vrij van gebreken. Bemonsteringsfouten in verband met interobservervariabiliteit en bemonstering van onvoldoende glomeruli voor uitgebreide informatie over de orgaanfunctie blijven in dit verband typische zorgen. Bovendien brengt de bereiding van specimen een aantal kwesties met zich mee, zoals een onvolledige beoordeling van het transplantaat in geval van bevroren delen, en verlenging van de proceduretijd voor paraffinesectie. Het verhoogde risico op bloedingen, die acuut kan lijken als microscopisch of grove hematurie, is echter de belangrijkste levensbedreigende complicatie die verband houdt met de biopsieprocedure. Om deze reden is het aantal toegestane biopten strikt beperkt in transplantatieprocedures, een factor die het vastleggen van dynamische veranderingen en tijdreeksanalyses via deze methode12,13,14belemmert . De voordelen van een histologische analyse moeten worden afgewogen tegen de risico’s die aan de methodologie verbonden zijn. De waarde van histologische bevindingen staat buiten kijf, maar ze verklaren de moleculaire mechanismen van de afwijkingen niet.
Metabolomics en lipidomics zijn de jongste domeinen van de “-omics” wetenschappelijke familie. De volledige set van lage moleculaire (<1,200 Da) menselijke metabolieten en lipiden verbonden binnen een metabolisch netwerk wordt gedefinieerd als een menselijke metabolome. Het genoom blijft gedurende zijn hele levensduur relatief constant, met lichte wijzigingen veroorzaakt door mutaties die zelden voorkomen. De metabolome is het product van genexpressie, dat zeer gevoelig is voor veranderingen in alle biologische processen en omgevingsfactoren. Het dynamische karakter van metabolieten en lipiden maakt ze perfecte indicatoren van de huidige orgaanconditie7,8,15,16. De SPME-methode die in het bovengenoemde protocol wordt voorgesteld, maakt het mogelijk om veranderingen in het orgaan tijdens het behoud ervan op te sporen, te beginnen met het verwijderen van organen uit het lichaam van de donor tot revascularisatie bij de ontvanger. De kleine diameter van de sonde (~ 200 μm) zorgt voor minimale invasieve werking en zorgt voor verschillende bemonsteringen van hetzelfde orgaan zonder schade aan het weefsel. Het uitvoeren van studies met behulp van nier, als de meest getransplanteerde orgaan, zorgt voor een beter begrip en verdere karakterisering van de metabole trajecten die verantwoordelijk zijn voor het afnemen van de kwaliteit en functie van grafts. De mogelijkheid van het monitoren van wijzigingen na verloop van tijd is zeker een belangrijk voordeel van de techniek in vergelijking met conventionele invasieve methoden zoals biopsie. De momenteel gepresenteerde analyse geïdentificeerd veranderde concentraties van verschillende groepen lipiden en metabolieten, met name van essentiële aminozuren, purines, purine nucleosides, en glycerophosfopiden. Deze resultaten komen overeen met eerdere weefselanalyserapporten5,6,17,18,19,20. Tot op heden zijn de meeste wetenschappelijke rapporten die gebruikmaken van metabolomics of lipidomics om processen te verklaren die complicaties veroorzaken na transplantatie of ischemie/reperfusieletsel (IRI) verschijnselen beperkt tot analyse van biofluïden21,22,23.
Elke klinische toepassing vereist optimalisatie van het bemonsteringsprotocol om ervoor te zorgen dat de prestaties van de analysemethode voldoen aan de verwachte criteria. In dit verband is het voordeel van het gebruik van SPME de mogelijkheid om de voorwaarden voor verschillende experimentele ontwerpen aan te passen. De verscheidenheid aan toegankelijke extractiefasen biedt een breed spectrum van geëxtraheerde metabolieten met gediversifieerde polariteiten. Tegelijkertijd kan dit worden beschouwd als een beperking van de methode vanwege het feit dat elke sorbent selectiviteit biedt ten opzichte van specifieke kenmerken en niet alle verbindingen in de monstermatrix extraheert. Opgemerkt moet worden dat SPME coatings alleen extraheren via vrije moleculen, en gewoon niet interageren met een gebonden fractie van de analyt. De biocompatibiliteit van de coatings introduceert geen toxiciteit in het weefsel, terwijl de extractie van grote moleculen zoals eiwitten wordt beperkt; als gevolg hiervan worden de enzymatische processen al in het stadium van monsterverzameling geremd en wordt de aanwezigheid van artefacten geminimaliseerd, wat een groot voordeel is ten opzichte van alternatieve bemonsteringsmethoden. De lengte van de coating beïnvloedt de efficiëntie van de extractie (d.w.z. de lengte van de coating wijst het oppervlak en het volume van de extractiefase aan); dus, langere coatings opleveren hogere terugvorderingen. Aan de andere kant zorgen kortere coatings voor een hogere ruimtelijke resolutie. Voor betrouwbare resultaten is het cruciaal om de sonde onder te dompelen op exact dezelfde diepte van de nierschors. Het te diep inbrengen veroorzaakt het risico om de nier medulla binnen te gaan. De tijd van de extractie is ook evenredig aan de extractie-efficiëntie. Daarom is de keuze van een optimale extractietijd een van de meest kritieke stappen in de ontwikkeling van SPME-methoden. De nauwkeurigheid van de tijdmeting biedt de hoogste herhaalbaarheid. In biologische toepassingen zoals die besproken, is er altijd een compromis tussen de gevoeligheid en herhaalbaarheid van het analytische protocol en de beperkingen van de medische procedure. Hoewel evenwichtsextractie de hoogste gevoeligheid biedt, worden om veiligheidsredenen vaak pre-evenwichtsvoorwaarden gebruikt in dergelijke toepassingen, omdat de extractietijd de totale duur van de operatie niet mag beïnvloeden. De efficiëntie van de desorptie wordt bepaald door het tijdstip van het proces en de samenstelling van het desorptieoplosmiddel, dat compatibel moet zijn met de mobiele fase die wordt gebruikt voor chromatografische scheiding9,10,11.
Een van de belangrijkste vereisten voor diagnostische instrumenten die worden gebruikt voor intrachirurgische beoordelingen is het tijdstip van analyse. De huidige pogingen worden gedaan om een snel instrument te ontwikkelen voor in vivo SPME-extractie die rechtstreeks via microfluïde open interface (MOI)24 of gecoate bladespray (CBS)25wordt gekoppeld aan een massaspectrometer. Dergelijke benaderingen zouden het mogelijk maken om analytische resultaten in reële of bijna realtime te onthullen. Het gebruik van dergelijke methoden voor pre-interventieanalyses van metabole en lipidomische profielen zou het besluitvormingsproces tijdens transplantatieprocedures kunnen verbeteren, waardoor de best mogelijke gepersonaliseerde aanpak en snelle respons in geval van orgaanfalen mogelijk worden.
Samengevat wordt verondersteld dat het voorgestelde protocol volledige metabolische en lipidomische profielen van niertransplantaten mogelijk zal maken, wat op zijn beurt een uitgebreide beoordeling van de kwaliteit van het orgaan en de karakterisering van de processen die verantwoordelijk zijn voor ischemie-reperfusieletsel zou bieden. De nieuwigheid van het project omvat het gebruik van solid-phase microextraction (SPME), het aanbieden van lage invasieve bemonstering van levende systemen, in combinatie met een van de meest innovatieve technologieën beschikbaar voor metabolomics en lipidomics analyse (bijvoorbeeld, de Orbitrap hoge resolutie massaspectrometer). SPME combineert het verzamelen, afzuiden en blussen van metabolieten in één stap, waardoor het een perfect hulpmiddel is voor snelle analyse. Er wordt verwacht dat dit protocol zal helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot wat pre-transplantatie voorwaarden van de nier verantwoordelijk zijn voor vertraagde orgaanfunctie of de disfuncties ervan na transplantatie, evenals hoe de graft behoud protocol beïnvloedt de biochemie van het orgaan. Dergelijke kennis zou niet alleen aanzienlijke gevolgen hebben voor de preventie van mogelijke complicaties in verband met transplantatie, maar kan ook bijdragen tot het verbeteren van de huidige protocollen voor het behoud van graft, waardoor het verlies van levensvatbaar transplantatieweefsel en het verlies van mensenlevens tot een minimum worden geminimaliseerd. De voorgestelde oplossing zal de deur openen voor verder onderzoek op dit gebied, met inbegrip van de validatie van specifieke potentiële biomarkers en verbetering van therapeutische resultaten in de transplantatie.
The authors have nothing to disclose.
De studie werd ondersteund door subsidie Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 van National Science Centre. De auteurs willen MilliporeSigma erkennen, een bedrijf van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland voor het leveren van SPME-apparaten. De life science business van Merck opereert als MilliporeSigma in de VS en Canada. Ook willen de auteurs Thermo Fisher Scientific bedanken voor de toegang tot Q-Exactive Focus orbitrap massaspectrometer. De auteurs willen dr. Aleksandra Woderska-Jasińska en het personeel van de afdeling Transplantatieologie en Algemene Chirurgie in Bydgoszcz bedanken voor hun vriendelijke hulp bij het project. BB wil prof. Janusz Pawliszyn bedanken voor de mogelijkheid van monstercollectie in toronto General Hospital tijdens haar verblijf aan de Universiteit van Waterloo.
Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
Chloroform | Merck | 1024441000 | |
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |