Изоляция миндалевидных моноядерных клеток для изучения Ex Vivo Врожденные иммунные реакции в человеческой мукозальной лимфоидной ткани
Summary
В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток здоровых людей, проходящих частичную хирургическую тонзиллектомию, изучать врожденные иммунные реакции при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях.
Abstract
Изучение изолированных клеток из слизистой оболочки связанных лимфоидных тканей (MALT) позволяет понять иммунный ответ клеток в патологиях с участием слизистого иммунитета, потому что они могут моделировать принимающих патогенных взаимодействий в тканях. В то время как изолированные клетки, полученные из тканей, были первой моделью клеточной культуры, их использование было пренебречь, потому что ткани могут быть трудно получить. В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток (ТМК) из здоровых человеческих миндалин для изучения врожденных иммунных реакций при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях. Изоляция ТМК от миндалин происходит быстро, потому что миндалины едва имеют эпителия и дают до миллиардов всех основных типов иммунных клеток. Этот метод позволяет выявлять выработку цитокинов с использованием нескольких методов, в том числе иммуноанализа, кЗКР, микроскопии, цитометрии потока и т.д., подобно использованию периферических моноядерных клеток (ПМБК) из крови. Кроме того, ТМК показывают более высокую чувствительность к тестированию на наркотики, чем PBMCs, которые необходимо учитывать для будущих анализов токсичности. Таким образом, ex vivo TMCs культур легко и доступной слизистой модели.
Introduction
Исследования на человеческих органах ограничены из-за доступности, а также очевидных этических причин. Тем не менее, они имеют важное значение для полного понимания сложности человеческой биологии. Культуры изолированных клеток (первичные культуры или клеточные линии) являются стандартной системой в исследованиях клеточной биологии из-за их наличия. В то время как изолированные клеточные культуры позволили выдающиеся открытия, использование клеточных линий пришло на более пристальное внимание, потому что они не полностью имитируют биологию органов vivo. Тем не менее, культура трехмерных клеток или тканей explants является весьма сложным4,,5,6. Действительно, часть ткани или органа очень неоднородна, потому что его клеточный состав отличается в зависимости от локализации в ткани. Таким образом, использование тканевых блоков требует анализа многих технических и биологических репликаций, что приводит к необходимости большого числа доноров или пациентов.
Связанные с слизистой оболочкой лимфоидные ткани (MALT) структурно похожи на лимфатические узлы, но имеют уникальные функции, потому что их основная роль заключается в регулировании слизистого иммунитета7. В отличие от лимфатических узлов, которые обычно расположены на некотором расстоянии от тканей, MALT, как правило, расположены непосредственно под эпителием слизистой оболочки ткани. Гистологически, они в основном состоят из высоких концентраций В и Т-клеток, но и антиген-представляющих клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. MALT составляют около 50% лимфоидной ткани в организме человека. MALT подразделяются на девять групп в зависимости от их местонахождения: GALT (кишка-), BALT (бронхус-), NALT (носовой), CALT (конъюнктивальный), LALT (гортань-), SALT (кожа-), VALT (вульво-), O-MALT (организовано) и D-MALT (диффенд). O-MALT в основном состоит из миндалин тонзиллярного кольца Вальдейера и является наиболее доступным MALT8,9. Действительно, миндалины, расположенные в ротоглоте, являются основным барьером, защищающим пищеварительные и дыхательные пути от (потенциальных) инвазивных микроорганизмов10. Кроме того, миндалины покрыты тонкой стратифицированной плоскоклеточной некератинирующей эпителием, поддерживаемой капсулой соединительной ткани, содержащей кровеносные сосуды, нервы и лимфатические, обеспечивая легкий доступ к иммунным клеткам11,12. Кроме того, тонзиллектомия, хирургический акт удаления миндалин, является общей процедурой, выполняемой на детей, имеющих расстройство сна дыхание, что делает миндалины легко доступны ткани13 в физиологических условиях.
Миндалины позволяют изучать иммунный клеточный ответ при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом. Действительно, при ВИЧ-инфекции, поскольку миндалины состоят из высокой концентрации иммунных клеток, они являются основной мишенью репликации вируса, но также производят большое количество цитокинов, которые не обнаружены в циркуляции14,15. В устойчивых состояниях редкие популяции врожденных клеток присутствуют в различных слизистых тканях, включая миндалины, но по существу отсутствуют в крови.
Таким образом, моноядерные клетки из миндалин (ТМК) являются более актуальной и сложной моделью, чем ПБМТ, и могут отвечать на более глубокие вопросы. С другой стороны, использование тканей эксплантов может быть сложным и не всегда имеет отношение к врожденным иммунным исследованиям. Таким образом, мы создали модель для изучения слизистой иммунной активации с помощью TMCs16. Здесь мы описываем метод эффективной изоляции ТМК от свежих человеческих миндалин. Этот метод позволяет восстановить большое количество иммунных клеток, сохраняя при этом их целостность для ex vivo исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Человеческие миндалины представляют собой интегративную и физиологическую модель ex vivo для изучения врожденных иммунных реакций в мукосальном интерфейсе, потому что они имитируют роль вторичного лимфоидного органа. Интересно, что клеточный состав ТМК похож на ПБМК и включает в себя в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным агентством по де ла Рехерш-сюр-ле-СИДА и ле Хепатитов ANRS (J-P. H) для экспериментов и стипендий N.B. (AAP 2017 166). N.S. признает поддержку со стороны ANRS для стипендий (AAP 2016 1), Европейской организации молекулярной биологии EMBO для стипендий (LT 834 2017), программы финансирования стартапа “Baustein” Медицинского факультета Ульмского университета (LSBN.0147) и Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
