Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain
Summary
Dans le protocole actuel, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdaler des humains sains subissant l’amygdalectomie chirurgicale partielle pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses.
Abstract
L’étude des cellules isolées des tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) permet de comprendre la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse, car elles peuvent modéliser les interactions hôte-pathogène dans le tissu. Alors que les cellules isolées dérivées des tissus étaient le premier modèle de culture cellulaire, leur utilisation a été négligée parce que les tissus peuvent être difficiles à obtenir. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdales (TMCs) à partir d’amygdales humaines saines pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses. L’isolement des TMCs des amygdales est rapide, parce que les amygdales ont à peine de l’épithélium et de produire jusqu’à des milliards de tous les principaux types de cellules immunitaires. Cette méthode permet la détection de la production de cytokines à l’aide de plusieurs techniques, y compris les immunotests, qPCR, microscopie, cytométrie de flux, etc., semblables à l’utilisation de cellules mononucléaires périphériques (PBMC) à partir du sang. De plus, les CTM présentent une plus grande sensibilité aux tests de dépistage des drogues que les PBMC, qui doivent être prises en considération pour les futurs tests de toxicité. Ainsi, les cultures ex vivo TMCs sont un modèle muqueuse facile et accessible.
Introduction
Les études sur les organes humains sont limitées en raison de l’accessibilité ainsi que des raisons éthiques évidentes. Cependant, ils sont essentiels pour bien comprendre la complexité de la biologie humaine. Les cultures de cellules isolées (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont un système standard dans les études de biologie cellulaire en raison de leur disponibilité. Bien que les cultures cellulaires isolées aient permis des découvertes exceptionnelles, l’utilisation de lignées cellulaires a fait l’objet d’un examen plus approfondi parce qu’elles n’imitent pas entièrement la biologie in vivo des organes. Cependant, la culture des cellules tridimensionnelles ou des explants de tissu est très complexe4,5,6. En effet, un morceau de tissu ou d’organe est fortement hétérogène parce que sa composition cellulaire diffère selon la localisation dans le tissu. Ainsi, l’utilisation de blocs de tissus nécessite l’analyse de nombreuses répliques techniques et biologiques, conduisant à la nécessité d’un grand nombre de donneurs ou de patients.
Les tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) sont structurellement semblables aux ganglions lymphatiques, mais ont des fonctions uniques, parce que leur rôle principal est de réguler l’immunité muqueuse7. Contrairement aux ganglions lymphatiques, qui sont généralement situés à une certaine distance des tissus, MALT sont généralement situés immédiatement en dessous de l’épithélium du tissu muqueuse. Histologiquement, ils sont principalement composés de fortes concentrations de cellules B et T, mais aussi de cellules présentant des antigènes telles que les macrophages et les cellules dendritiques. MALT constituent environ 50% du tissu lymphoïde dans le corps humain. Les MALT sont subdivisés en neuf groupes selon leur emplacement : GALT (intestin-), BALT (bronches-), NALT (nasal-), CALT (conjonctival), LALT (larynx-), SALT (peau-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisé) et D-MALT (diffusé). L’O-MALT est principalement composé des amygdales de l’anneau amygdale de Waldeyer et est le malt le plus accessible8,9. En effet, les amygdales situées dans l’oropharynx constituent la principale barrière protégeant les voies digestives et respiratoires contre les micro-organismes (potentiels) invasifs10. En outre, les amygdales sont couvertes par un épithélium squameux non kératinisant stratifié fin, soutenu par une capsule de tissu conjonctif contenant des vaisseaux sanguins, les nerfs et les lymphatiques, offrant un accès facile aux cellules immunitaires11,12. En outre, l’amygdalectomie, l’acte chirurgical d’enlever les amygdales, est une procédure courante effectuée sur les enfants ayant une respiration trouble du sommeil, ce qui rend les amygdales un tissu facilement disponible13 dans les milieux physiologiques.
Les amygdales permettent l’étude de la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse. En effet, dans l’infection par le VIH, parce que les amygdales sont composées d’une forte concentration de cellules immunitaires, ils sont la cible principale de la réplication virale, mais produisent également une grande quantité de cytokines qui ne sont pas détectés dans la circulation14,15. À des états stables, de rares populations de cellules innées sont présentes dans divers tissus muqueuses, y compris les amygdales, mais sont essentiellement absentes du sang.
Ainsi, les cellules mononucléaires des amygdales (TMC) sont un modèle plus pertinent et complexe que les PBMC et peuvent répondre à des questions plus profondes. D’autre part, l’utilisation d’explants de tissu peut être complexe et pas toujours pertinente pour les études immunitaires innées. Ainsi, nous avons établi un modèle pour étudier l’activation immunitaire muqueuse à l’aide de TMCs16. Ici, nous décrivons une méthode pour l’isolement efficace des TMCs des amygdales humaines fraîches. Cette méthode permet la récupération d’un grand nombre de cellules immunitaires tout en gardant leur intégrité pour les études ex vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les amygdales humaines représentent un modèle ex vivo intégratif et physiologique pour étudier les réponses immunitaires innées à l’interface muqueuse, parce qu’elles imitent le rôle d’un organe lymphoïde secondaire. Fait intéressant, la composition cellulaire des TMC est similaire aux PBMC et comprend toutes les principales populations de cellules, bien que leur pourcentage puisse être différent des PBMC du sang (figure 1). D’autres populations peuvent également être t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Agence nationale de la recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) pour les expériences et la bourse du N.-B. (AAP 2017 166). N.S. reconnaît le soutien de l’ANRS pour la bourse (AAP 2016 1), de l’Organisation européenne de biologie moléculaire EMBO for Fellowship (LT 834 2017), du programme de financement de démarrage « Baustein » de la Faculté de médecine de l’Université d’Ulm (LSBN.0147) et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
