Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi
Summary
Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.
Abstract
Miyokard enfarktüsü (MI) Batı dünyasında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Son on yılda, gen tedavisi kalp hastalığı için umut verici bir tedavi seçeneği haline gelmiştir, verimliliği ve olağanüstü terapötik etkileri nedeniyle. MI sonrası hasarlı dokuyu onarmak için yapılan çeşitli çalışmalarda DNA tabanlı veya viral gen terapisi uygulandı, ancak teslim edilen genlerin, ödemin, aritminin ve kardiyak hipertrofisin zayıf ve kontrolsüz ekspresyonu nedeniyle önemli engellerle karşı karşıya kaldılar. Sentetik modifiye mRNA (modRNA), genomik entegrasyon riski olmaksızın kalp dokusuna yüksek, geçici, güvenli, immünojenik olmayan ve kontrollü mRNA iletimi sunan yeni bir gen terapisi yaklaşımı sunar. Kalpteki çan şekilli farmakokinetiği ile birleşen bu dikkat çekici özellikleri nedeniyle, modRNA kalp hastalığının tedavisinde cazip bir yaklaşım haline gelmiştir. Ancak, in vivo etkinliğini artırmak için, tutarlı ve güvenilir bir teslimat yöntemi takip edilmesi gerekir. Bu nedenle, in vivo uygulamaları için modRNA kullanımımodRNA kullanımda modRNA teslim verimliliğini ve verim tutarlılığını en üst düzeye çıkarmak için, bir fare MI modelinde modRNA intrakardiyak enjeksiyonun hazırlanması ve tesliminde optimize edilmiş bir yöntem sunulmuştur. Bu protokol, modRNA teslimatını temel ve çevirisel araştırmalar için daha erişilebilir hale getirecektir.
Introduction
Gen tedavisi, insan hastalıklarının tedavisi, tedavisi veya önlenmesi için nükleik asitlerin teslimini içeren güçlü bir araçtır. Kalp hastalığı için tanı ve tedavi yaklaşımlarında kaydedilen ilerlemeye rağmen, miyokard enfarktüsü (MI) ve kalp yetmezliği (HF) genlerin tesliminde sınırlı başarı olmuştur. Gen terapisi süreci ne kadar basit görünse de, belirli bir teslimat aracını kullanmadan önce optimize edilmesi gereken birçok faktörü göz önünde bulundurarak oldukça karmaşık bir yaklaşımdır. Doğru teslim vektörü insan vücudunda immünojenik olmayan, verimli ve kararlı olmalıdır. Bu alandaki çalışmalar iki tür dağıtım sistemi oluşturmuştur: viral veya viral olmayan. Adenovirüs, retrovirüs, lentivirüs veya adeno ilişkili virüs tarafından gen transferi de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan viral sistemler, olağanüstü transdüksiyon kapasitesi göstermiştir. Ancak, kliniklerde kullanımları nedeniyle güçlü bağışıklık yanıtı indüklenensınırlıdır 1, tümörigenez riski2, veya nötralize antikorların varlığı3, tüm bunlar insan gen tedavisinde viral vektörlerin geniş ve etkili uygulanması için önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Öte yandan, onların etkileyici ifade desen rağmen, çıplak plazmid DNA teslim düşük transfksiyon verimliliği görüntüler, mRNA transferi RNase tarafından bozulmaya yüksek immünjenite ve duyarlılık sunarken4.
mRNA alanında kapsamlı bir araştırma ile, modRNA gelenekselvektörler5 üzerinde sayısız avantajları nedeniyle kalp ve çeşitli diğer organlara genlerin teslimi için cazip bir araç haline gelmiştir. Doğal olarak meydana gelen psödoürin ile idrar tam değiştirilmesi daha sağlam ve geçici protein ekspresyonu sonuçları, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ve genomik entegrasyon riski minimal indüksiyon ile6. Son zamanlarda kurulan protokoller, sentetik mRNA7’ninstabilitesini ve transability’sini artırarak protein çevirisini daha da artıran optimize edilmiş bir anti-ters kapak analogu (ARCA) kullanmaktadır.
Önceki raporlar çeşitli muhabir veya fonksiyonel genlerin ifade göstermiştir mi sonra kemirgen miyokardinde modRNA tarafından teslim. ModRNA uygulamaları ile, kardiyomiyositler ve nonkardiyomiyositler de dahil olmak üzere miyokardiyumun önemli alanları, anjiyogenez9,10,kardiyak hücre sağkalım11ve kardiyomiyosit proliferasyonu12neden olmak için başarıyla post-kardiyak yaralanma8 transfected edilmiştir. Mutasyona uğramış insan follistatin benzeri 1 için kodlanmış modRNA tek bir uygulama fare yetişkin CMs çoğalmasını indükler ve önemli ölçüde kardiyak fonksiyonu artırır, skar boyutunu azaltır, ve kılcal damar yoğunluğunu artırır 4 hafta post-MI12. Daha yeni bir çalışmada bir domuz modeli nde VEGFA modRNA uygulaması ile MI sonra geliştirilmiş kardiyak fonksiyon bildirdi10.
Bu nedenle, kardiyak alanda modRNA artan popülaritesi ile, geliştirmek ve kalp sonrası MI modRNA teslimi için bir protokol optimize etmek esastır. Burada herhangi bir bağışıklık yanıtı uyarıcı olmadan sağlam, istikrarlı protein ifadesi sağlayan bir biyouyumlu sitrat-salin formülasyonu saf ve optimize modRNA hazırlanması ve teslim açıklayan bir protokoldür. Bu protokol ve videoda gösterilen yöntem, sol anterior inen arterin (LAD) kalıcı ligasyonu ile fare MI’nin standart cerrahi işlemini ve ardından üç adet modRNA intrakardiyak enjeksiyonunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, modRNA uygulamasını kardiyak gen tedavisi için yaygın olarak erişilebilir hale getirmek için minnet miyokardiyumuna modRNA teslimatının son derece doğru ve tekrarlanabilir bir yöntemini açıkça tanımlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen tedavisi önemli ölçüde kalp hastalığının tedavisi ilerlemek için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, HF tedavisi için ilk klinik çalışmalarda kullanılan geleneksel araçlar sınırlı başarı göstermiştir ve ciddi yan etkileri ile ilişkilidir. Modifiye RNA sürekli kalpte bir gen transfer aracı olarak popülerlik kazanıyor bir nonviral gen teslim sunuyor. ModRNA çeviri için genlerin hiçbir nükleer lokalizasyon gerektirir, ve böylece protein verimli ve hızlı bir ifade sunuyor. Ayr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Ann Anu Kurian’ı bu el yazmasına yardımlarından dolayı kabul ediyorlar. Bu çalışma Zangi laboratuvarına verilen kardiyoloji başlangıç hibesi ve ayrıca NIH hibe R01 HL142768-01 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
