קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה

מאז הקמתה על ידי Porath ועמיתים לעבודה¹, כרומטוגרפיה של זיקה מתכת כרומטוגרפית (IMAC) הפך לשיטה של בחירה כדי להפריד במהירות חלבונים בהתבסס על יכולתם להתחבר עם יוני מתכת מעבר כגון zn^{2 +}, Ni^{2 +}, Cu^{2 +}, ו-co^{2 +}. זה נעשה בדרך כלל באמצעות הנדסה התגים פולי-histidine והוא כיום אחד שיטות הטיהור הנפוצות ביותר כרומטוגרפי לבידוד של חלבונים רקומביננטי². IMAC יש גם מצאו יישומים מעבר לטיהור חלבון רקומביננטי כדרך לבודד quinolones, טטרציקווים, קוגליקוצידי, macrolides, ו β-lactams עבור ניתוח לדוגמה מזון³ וכצעד בזיהוי חלבון סרום דם סמנים לכבד וסרטן הלבלב^4,5. לא באופן מפתיע, IMAC יש גם להיות שיטה של בחירה עבור בידוד של מספר אנזימים ביואנרגיה יליד^6,7,8,9,10. עם זאת, יישום מוצלח של שיטות טיהור אלה למחקרים על חלבונים ביו-אנרגטיים פעילים ומותנים בנוכחות של רמות זניח של מתכות מתכתיות מתוך מטריצת הטור אל החומק. מתכות דיגרפיות המשמשות בדרך כלל ב-IMAC מוכרות משמעות ביולוגית פתולוגית, אפילו בריכוזים נמוכים^11,12. ההשפעה הפיזיולוגית של מתכות אלה מודגשת ביותר במערכות bioenergetic, שם הם יכולים להוכיח קטלני כמו מעכבי של נשימה תאית או הפוטוסינתזה^13,14,15. בעיות דומות הן בלתי נמנעת עבור רוב שיעורי החלבונים שבהם מתכות שיורית מזהם יכול להפריע לפונקציות ביולוגיות של חלבון או לאפיון עם טכניקות ביולוגיות והביופיסיים.

בעוד הרמות של זיהום מתכת תחת תנאים אוקסיגון ושימוש בסרמדול כמו הימנעות הם בדרך כלל נמוך¹⁶, חלבון בדלנים שבוצעו בנוכחות של ציסטאין מפחיתה סוכנים (dtt, β-mercaptoethanol, וכו ‘) או עם מכשירי כלים חזקים כמו היסטידין^17,18 או ethylenediamiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii באופן דומה, מאז יוני מתכת ב שרפים IMAC מתואמים לעתים קרובות על ידי קבוצות קרבוקסילית חלבון שבוצעו בתנאים חומציים צפויים גם להיות רמות גבוהות בהרבה של זיהום מתכת. תוכן מתכת בפתרונות ניתן להעריך באמצעות ספקטרוסקופיית קליטת האטום (AAS) ומצמידים באופן משולב פלזמה המוני הספקטרומטריה (הקאמרי-MS) עד למגבלה של זיהוי ב-ppb-ppt טווח^21,22,23,24. למרבה הצער, AAS ו הקאמרי-MS אינם אמצעי מציאותי לאיתור במעבדה ביוכימיה מסורתית כמו שיטות אלה ידרוש גישה לציוד והדרכה מיוחדים.

העבודה הקודמת של בריטני^25,26 חקרה את השימוש בהידרוינאפיול כחול (hnb) כדרך לזיהוי נוכחות של מתכות מעבר בתמיסה. עם זאת, היו כמה סתירות פנימיות בנתונים²⁰ ועבודות אלה לא הציעו פרוטוקול הולם. מחקרים של Temel ואח ‘²⁷ ופרטי ואח ‘²⁸ הורחב על עבודתה של בריטני עם hnb כמחוון מתכת פוטנציאלי. עם זאת, Temel פיתח פרוטוקול שעושה שימוש AAS עבור ניתוח לדוגמה, באמצעות HNB רק כסוכן מכלפת. המחקר של פרטי השתמשו בשינוי בספקטרום של HNB בשנת 563 nm, אזור של ספקטרום הצבע החופשי HNB החופף בכבדות עם הספקטרום של מכלולי מתכת של HNB ב-pH 5.7, מה שהופך את רגישות הגישה נמוכה למדי, וכתוצאה מכך מתכת חלשה יחסית מחייבת זיקה²⁰. כדי לטפל בבעיות במעבדה שלנו עם Ni^{2 +} טיפת מ-IMAC, הרחבנו את העבודה שנעשתה על ידי בריטני^25,26 ו ferreria²⁸ לפתח שיטת קל מסוגל לזהות את רמות nanomolar של מספר מתכות מעבר. הראנו כי HNB נקשר ניקל ומשותף אחרים עבור מתכות IMAC עם כריכת משנה-nanomolar איגוד וטופס 1:1 מורכבות מעל מגוון רחב של ערכי pH²⁰. הבקשה שדווחה כאן מבוססת על ממצאים אלה ומנצלת שינויי ספיגה בספקטרום HNB ב-647 ננומטר לצורך כימות מתכת. ניתן לבצע את השינוי בטווח ה-pH הפיזיולוגי באמצעות מאגרים ומכשור משותפים, המצויים במעבדת ביוכימיה טיפוסית באמצעות איתור וככמת של מכלולי מתכות לצביעת מתכת והשינוי הקשור בספיגת הצבע החופשי כאשר הוא נקשר למתכת.