Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

La termoforesis a microescala es una técnica relativamente nueva para determinar constantes de disociación (KD) y constantes de inhibición (_IC50) entre ligandos bioquímicamente relevantes. El minorista comercial líder para MST (por ejemplo, NanoTemper) ofrece dos tecnologías populares de MST: 1) MST sin etiquetas que requiere una etiqueta fluorescente, y 2) termoforesis etiquetada utilizando la fluorescencia inherente de proteínas dependientes del número de residuos aromáticos presentes en cada ^proteína1. Una desventaja de la termoforesis sin etiqueta es que, en la mayoría de los casos, no permite la medición de las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, puede ser posible diseñar proteínas sin aminoácidos aromáticos como el triptófano para su uso en la termoforesis sin ^etiqueta2.

MST mide el movimiento de partículas en respuesta a la inducción de campos de temperatura microscópicos iniciados por un láser infrarrojo en las tecnologías actualmente ^disponibles1. MST se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína, las interacciones proteína-lípido, la molécula pequeña de proteína, los experimentos de competencia e incluso las interacciones entre moléculas pequeñas, siempre y cuando se pueda producir suficiente separación de señales. Además, MST permite la medición de interacciones basadas en membrana-proteína incrustadas en liposomas o nanodiscos. La termoforesis etiquetada aprovecha el uso de etiquetas marcadas fluorescentemente que permiten la separación químicamente controlable de la señal entre el ligando y el analito. Los valores de KD se pueden obtener mediante termoforesis para interacciones que implican la unión a proteínas a bajas concentraciones nanomolares, que en la mayoría de los casos es una concentración de proteína mucho menor que la requerida para la calorimetría isotérmica (ITC)³. Además, MST no tiene requisitos de amortiguación estrictos como se requiere para la resonancia de plasmón de superficie (SPR)⁴ y la termoforesis etiquetada incluso se puede usar para medir constantes de unión de proteínas de interés a partir de soluciones proteicas no completamente ^purificadas5 con etiquetas fluorescentes insertadas ^{genéticamente6}. Una desventaja de MST es que los parámetros cinéticos no se pueden obtener fácilmente para MST como en ^SPR2.

Las mediciones de termoforesis dependen de la diferencia de temperatura local de una solución. Este calor se puede generar a partir de un láser infrarrojo. El dispositivo MST tiene un detector de fluorescencia acoplado a un haz infrarrojo (IR) y puede detectar cambios en la fluorescencia de los cambios de concentración local de las moléculas fluorescentes en el punto donde se dirige el láser IR. El dispositivo MST utiliza un láser dirigido a IR acoplado directamente a un detector de fluorescencia enfocado en el mismo punto en el que se genera el calor en la solución. Esto permite una detección robusta de los cambios de temperatura correspondientes al agotamiento de las moléculas en el punto de calor generado por el láser IR. La fluorescencia medida generalmente disminuye más cerca del láser IR en respuesta a los aumentos de temperatura. Las diferencias medidas como resultado pueden deberse a múltiples factores, incluida la carga, el tamaño o la entropía de la solvatación. Estas diferencias se miden como cambios en la fluorescencia en respuesta a la inducción de calor o al movimiento de moléculas de partes calientes a más frías del capilar.

Al cargar un capilar con una solución dada, es importante dejar aire en cada extremo del capilar y no cargar el capilar completamente lleno. El capilar comercial contiene aproximadamente 10 μL de solución. Uno puede lograr mediciones precisas con 5 μL de solución siempre que la solución se manipule hasta el centro del capilar, no haya burbujas de aire (potencialmente desgasificación antes de la carga capilar), y uno tenga cuidado al cargar el bastidor para no empujar la solución desde el centro del capilar, donde se dirige el láser infrarrojo. Si el láser no entra en contacto completamente con la solución, lo más probable es que el resultado sea una de las tres salidas inutilizables para esa concentración: 1) detección de fluorescencia nula o baja, 2) detección de fluorescencia más alta (potencialmente con pico irregular), o 3) detección de fluorescencia dentro de otros valores de titulación dada, pero con un pico irregular y no redondeado.

Para la termoforesis etiquetada es óptimo tener una señal de fluorescencia por encima de 200 y por debajo de 2000 unidades de ^{fluorescencia7}. El dispositivo MST utiliza un rango de intensidades LED de 0 a 100, que se pueden seleccionar para lograr una señal superior a 200 o inferior a 2000. Alternativamente, se pueden usar diferentes concentraciones del ligando marcado para modificar la señal de fluorescencia a un nivel óptimo. Es importante ejecutar un escaneo de tapa con una medición MST dada como referencia al analizar datos, ya que un escaneo de tapa deficiente a menudo puede resultar en un punto que luego se puede determinar que es un valor atípico. Cada carrera debe tomar aproximadamente 30 minutos si se mide una sola potencia MST con un escaneo de tapa. Los dispositivos comerciales permiten cambios en la potencia MST. En versiones de software anteriores, esto se podía establecer de 0 a 100; y en versiones posteriores se puede seleccionar MST bajo, medio o alto. Para lograr trazas robustas, un investigador puede necesitar probar cada una de ellas y decidir qué configuración de MST da como resultado los datos más robustos para una interacción determinada.