Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

Questo lavoro illustra la dissezione delle regioni cerebrali congelate per l’estrazione di acido nucleico o proteina di alta qualità utilizzando un riferimento, come l’Atlante del cervello del mouse Allen¹, come guida. In questa tecnica, i cervelli sono congelati da flash e vengono conservati a -80 gradi centigradi per la sezionamento e la dissezione successivi, pur essendo mantenuti in condizioni congelate. Questo processo permette al ricercatore di raccogliere un gran numero di cervelli in una sessione e successivamente sezionarli per una raccolta accurata di più regioni del cervello.

La raccolta accurata di regioni di interesse cerebrali (ROI) è spesso necessaria quando si risponde a domande relative all’espressione genica e proteica. Mentre farmacologia, elettrofisiologia e optogenetica possono essere utilizzate su roditori selvatici o geneticamente modificati per aiutare a chiarire i cambiamenti molecolari alla base dei comportamenti osservati^2,3,4, la misurazione dei cambiamenti indotti nei trascrittomi e nei proteomi è spesso utilizzata per sostenere questi risultati. Tecniche come la narrazione quantitativa inversa della polimerasi di trascrizione inversa (RT-qPCR), il gonfiore occidentale, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ e HPLC⁷ sono robuste e relativamente basse in termini di costi, consentendo a molti laboratori di studiare cambiamenti molecolari indotti all’interno di piccole regioni cerebrali^2,4,5,6.

Ci sono diversi modi per estrarre e purificare l’acido nucleico o la proteina dalle regioni cerebrali^8,9,10,11,12. Molti laboratori raccolgono le regioni del cervello raffreddando e tagliando i cervelli sul ghiaccio al momento del raccolto^9,13. Anche se questo approccio può portare ad acido nucleico e proteine di alta qualità, è un po ‘limitato nel tempo in quanto la degradazione all’interno del microambiente del tessuto può avvenire a queste temperature. Ciò può essere particolarmente vero quando si tenta di sezionare un gran numero di animali o ROI in una sola seduta. Mantenere i campioni congelati aiuta a mantenere molecole bersaglio labili, fornendo al ricercatore il tempo per confrontare attentamente i punti di riferimento su entrambi i lati di ogni sezione nello sforzo di raccogliere campioni relativamente puri. La cattura laser è un altro modo per raccogliere tessuti per l’analisi dell’RNA o delle proteine dalle aree cerebrali¹⁰. Questa procedura è superiore alla dissezione meccanica in quanto i ROI molto piccoli e di forma irregolare possono essere identificati e isolati. Tuttavia, la cattura laser è limitata dall’uso di costose attrezzature e reagenti, richiede molto tempo e può anche essere più suscettibile alla degradazione del campione.

La dissezione di micropunch sui tessuti congelati non è nuova. I primi documenti di Miklos Palkovits e altri descrivono le tecniche di base nel dettaglio^14,15. Questa presentazione segue in gran parte il lavoro originale, con alcuni miglioramenti per facilitare l’efficienza e ridurre i costi delle attrezzature necessarie. Per esempio, le sezioni cerebrali sono fatte in un blocco cerebrale congelato piuttosto che su un criostato. Questo produce sezioni più spesse che riduce il numero di sezioni necessarie per raccogliere campioni di ROI. Questo metodo seziona anche i campioni su una piastra di vetro congelato che si trova sul ghiaccio secco all’interno di una scatola isolata. Questo produce una fase di subcongelamento sul banco su cui lavorare. Le sezioni sezionate in questo modo sono facilmente manipolabili, consentendo al ricercatore di confrontare entrambi i lati di ogni sezione con un riferimento al fine di limitare la contaminazione da regioni al di fuori del ROI desiderato.

I vantaggi di questo protocollo sono che 1) il cervello è mantenuto in una condizione congelata durante tutto il processo, che aiuta a preservare le proteine e l’acido nucleico e dà al ricercatore il tempo di raccogliere con attenzione i ROI, e 2) i reagenti necessari sono poco costosi e si trovano nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. In questo processo, interi cervelli sono sezionato a 0,5–1,0 mm in una matrice cerebrale e collocati su una piastra di vetro congelato che viene continuamente raffreddata con ghiaccio secco. Punti di riferimento trovati nell’Atlante del cervello di Allen¹ o in altri atlanti cerebrali^16,17 vengono utilizzati per identificare le regioni di interesse, che vengono poi sezionati utilizzando un pugno a freddo o bisturi. Poiché il tessuto non viene mai scongelato, le regioni raccolte in questo modo forniscono RNA e proteine di alta qualità per le analisi a valle.