Summary

Индуцирование посттравматической эпилепсии в мышиной модели повторяющихся диффузных травматических травм головного мозга

Published: February 10, 2020
doi:

Summary

Этот систематический протокол описывает новую модель животных посттравматической эпилепсии после повторяющихся легкой черепно-мозговой травмы. Первая часть детали шаги для индукции черепно-мозговой травмы с использованием модифицированной модели падения веса. Вторая часть содержит инструкции по хирургическому подходу к одно- и многоканальным системам получения электроэнцефалографических данных.

Abstract

Травматическая черепно-мозговая травма (ТБИ) является основной причиной приобретенной эпилепсии. TBI может привести к очаговой или диффузной черепно-мозговой травмы. Фокусная травма является результатом прямых механических сил, иногда проникающих через череп, создавая прямое повреждение в тканях мозга. Они видны во время визуализации мозга как области с ушибами, рваной раной и кровоизлиянием. Очаговые поражения вызывают гибель нейронов и образование глиальных шрамов и присутствуют у 20%-25% всех людей, которые несут TBI. Однако в большинстве случаев ТБИ, травмы вызваны ускорением силы замедления и последующего стрижки тканей, в результате чего нефокальные, диффузные повреждения. Субпопуляция пациентов ТБИ продолжает развиваться посттравматическая эпилепсия (ПТЭ) после периода задержки месяцев или лет. В настоящее время невозможно предсказать, какие пациенты будут развиваться PTE, и судороги у пациентов PTE являются сложными для контроля, что требует дальнейших исследований. До недавнего времени поле ограничивалось только двумя моделями животных/грызунов с проверенными спонтанными посттравматическими припадками, оба из них представляли большие очаговые повреждения с массивной потерей тканей в коре, а иногда и подкорковых структурах. В отличие от этих подходов, было установлено, что диффузный TBI индуцированных с помощью модифицированной модели падения веса достаточно, чтобы инициировать развитие спонтанного судорожных и не судорожных припадков, даже при отсутствии очаговых поражений или потери тканей. Подобно пациентам с приобретенными посттравматическими эпилепсией, эта модель представляет собой период задержки после травмы до начала захвата. В этом протоколе, сообщество будет предоставлено с новой моделью посттравматической эпилепсии, подробно, как вызвать диффузные не-повреждение TBI следуют непрерывный долгосрочный видео-электроэнцефалографический мониторинг животных в течение нескольких месяцев. Этот протокол будет подробно обработки животных, процедура падения веса, размещение электродов для двух систем приобретения, а также частые проблемы, возникающие во время каждого из этапов операции, послеоперационный мониторинг, и приобретение данных.

Introduction

Каждый год TBI затрагивает, по оценкам, 60 миллионов человек во всем мире. Воздействие лиц подвергаются более высокому риску развития эпилепсии, которая может проявляться лет после первоначальной травмы. Хотя тяжелые TBIs связаны с более высоким риском эпилепсии, даже мягкий ТБИ увеличивает шансы человека на развитие эпилепсии1,2,3,4. Все TBIs могут быть классифицированы как координационные, диффузные, или сочетание того и другого. Диффузная черепно-мозговая травма, присутствуюая во многих, если не во всех ТБО, является результатом стрижки мозгов различной плотности друг против друга из-за ускорения замедления и вращательных сил. По определению, диффузная травма происходит только в изоляции в мягкой / сотрясение не проникающей черепно-мозговой травмы, в которой не поражения головного мозга видны на компьютерной томографии5.

В настоящее время существуют две критические проблемы в области ведения пациентов, у которых развивается посттравматическая эпилепсия (ПТЭ). Во-первых, как только ПТЭ проявляется, судороги устойчивы к имеющимся противоэпилептических препаратов (AED)6. Во-вторых, AEDs одинаково неэффективны в профилактике эпилептогенеза, и нет эффективных альтернативных терапевтических подходов. Для того, чтобы решить этот дефицит и найти лучшие терапевтические цели и кандидатов на лечение, необходимо будет изучить новые клеточные и молекулярные механизмы в корне PTE6.

Одной из характерных особенностей посттравматической эпилепсии является скрытый период между первоначальным травматическим событием и наступлением спонтанных, неспровоцированных, периодических припадков. События, которые происходят в этом временном окне являются естественным фокусом для исследователей, потому что это время окно может позволить лечение и профилактика PTE в целом. Модели животных наиболее часто используются для этого исследования, потому что они предлагают несколько различных преимуществ, не последним из которых является то, что непрерывный мониторинг человеческих пациентов будет непрактичным и дорогостоящим в течение таких потенциально длительных периодов времени. Кроме того, клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе эпилептогенеза, могут быть исследованы только в моделях животных.

Модели животных со спонтанными посттравматическими припадками и эпилепсией предпочтительнее перед моделями, где припадки индуцируются после ТБИ менее физиологически значимыми средствами, такими как хемоконвульяторы или электрическая стимуляция остро, хронически или разжиганием. Спонтанные посттравматические модели припадков тест, как TBI изменяет здоровую сеть мозга, что приводит к эпилептогенезу. Исследования с использованием дополнительной стимуляции после TBI оценить, как воздействие TBI снижает порог захвата и влияет на восприимчивость к судорогам. Преимущества животных моделей с изъятиями, вызванными химически или с электрической стимуляцией, заключаются в тестировании специфических механизмов огнеупорности к AED и эффективности существующих и новых AED. Тем не менее, степень релевантности и перевода этих данных на людей может быть неоднозначной7 из-за следующего: 1) механизмы захвата могут отличаться от тех, которые индуцируются только ТБИ; 2) не все из этих моделей приводят к спонтанным припадков7; 3) поражения, созданные судорожным агентом себя, с канюлей, необходимых для его доставки, или путем стимулирования размещения электродов в глубинных структурах (например, гиппокампа или миндалины) уже может вызвать повышенную восприимчивость захвата и даже гиппокампа эпилептиформных потенциалов эпилептиформных7. Кроме того, некоторые судорожные агенты (т.е. кайновая кислота) производят прямые поражения гиппокампа и склероз, что не характерно после диффузного ТБИ.

До недавнего времени существовали только две животные модели посттравматической эпилепсии: контролируемое воздействие корки (CCI, фокус) или жидкие ударные травмы (FPI, фокусные и диффузные)8. Обе модели приводят к большим очаговым поражениям наряду с потерей тканей, кровоизлиянием и глиозом у грызунов8. Эти модели имитируют посттравматическую эпилепсию, вызванную крупными очаговыми поражениями. Недавнее исследование показало, что повторный (3x) диффузный ТБИ достаточен для развития спонтанных припадков и эпилепсии у мышей даже при отсутствии очаговых поражений9,добавляя третью модель грызунов PTE с подтвержденными спонтанными периодическими припадками. Эта новая модель имитирует клеточные и молекулярные изменения, вызванные диффузной TBI, лучше представляя население с мягкими, сотрясением туберкулеза. В этой модели, скрытый период в три недели или более до начала захвата и появление поздних, спонтанных, повторяющихся изъятий позволяет исследовать коренные причины посттравматического эпилептогенеза, тестирование эффективности профилактических подходов и новых терапевтических кандидатов после начала захвата, и имеет потенциал для развития биомаркеров посттравматического эпилепгенеза, потому что примерно половина животных развиваются посттравматического эпилепсии.

Выбор животной модели для изучения посттравматической эпилепсии зависит от научного вопроса, типа исследуемой черепно-мозговой травмы и того, какие инструменты будут использоваться для определения основных клеточных и молекулярных механизмов. В конечном счете, любая модель посттравматической эпилепсии должна продемонстрировать как появление спонтанных припадков после ТБИ, так и начальный период задержки в подмножестве животных ТБИ, потому что не все пациенты, которые несут ТБИ, переходят к развитию эпилепсии. Для этого в этом протоколе используется электроэнцефалография (ЭЭГ) с одновременным приобретением видео. Понимание технических аспектов, лежащих в основе оборудования и подходов к сбору данных, имеет решающее значение для точной интерпретации данных. Важнейшие аппаратные аспекты включают тип системы записи, тип электродов (винт или провод свинца) и материал, из которого они сделаны, синхронизированное приобретение видео (как часть системы ЭЭГ или третьей стороны), а также свойства компьютерной системы. Крайне важно установить соответствующие параметры приобретения в любом типе системы в зависимости от цели исследования, событий ЭЭГ, представляющих интерес, метода дальнейшего анализа и устойчивости хранения данных. Наконец, необходимо учитывать метод конфигурации электрода (монтаж), так как каждый из них имеет преимущества и недостатки и повлияет на интерпретацию данных.

Этот протокол подробно, как использовать модифицированные Marmarou падение веса модели10,11, чтобы вызвать диффузные травмы в результате спонтанного, неспровоцированные, периодические судороги у мышей, описывает хирургические подходы к приобретению одного и многоканального непрерывного, и синхронизированные видео ЭЭГ с использованием монополярного, биполярного или смешанного монтажа.

Protocol

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического университета Вирджинии и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» На?…

Representative Results

В описанном здесь протоколе описывается метод индукции диффузной травмы в изоляции (например, при отсутствии очагового поражения) с помощью мышиной модели повторяющихся диффузных TBI (Рисунок 1). На рисунке 1А изображено устройство для снижения в…

Discussion

В отличие от моделей CCI и FPI, вызывающих либо фокусные или комбинации фокусных и диффузных травм, модель повторяющихся диффузных TBI, описанная в данном протоколе, позволяет индукцию диффузной травмы при отсутствии очаговой черепно-мозговой травмы и не требует переломов кожи головы или ч…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/United States и CURE на основе гранта CURE, полученного от Армии США медицинских исследований и материальных средств командования, Министерство обороны (DOD), через психологическое здоровье и травматического мозга программы исследований в соответствии с премией No. W81XWH-15-2-0069. Иван Квидхук высоко ценится за коррективы рукописи.

Materials

0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8209 0.10 inch long stainless steel
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8403 0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8212 0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA MS333/8-A/SPC 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8201 2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide Pharmacy
3EEG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8235-SM-C custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
C57BL/6 mice Harlan/Envigo Laboratories Inc male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory male, 12-16 weeks old
Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357 NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic Pharmacy
Dental cement and solvent kit Stoelting Co., USA 51459
Drill Foredom HP4-917
Drill bit Meisinger USA, LLC, USA HM1-005-HP 0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer Cellpoint Scientific, USA Germinator 500
EEG System 1 Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2 Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70% VWR, USA 71001-652 KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment Pro Labs Ltd, USA Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Hair removal product Church & Dwight Co., Inc., USA Nair cream
Isoflurane MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Povidone-iodine surgical solution Purdue Products, USA 004677 Betadine
Rimadyl/Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357
Solder Harware store
Soldering iron Weller, USA WP35 ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads Fisher Scientific, USA 22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads Cardinal Health, USA 3520
Tissue adhesive 3M Animal Care Products, USA 1469SB

References

  1. Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
  2. Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, 4-9 (2009).
  3. Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
  4. Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
  5. Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
  6. Piccenna, L., Shears, G., O’Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
  7. Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  8. Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
  9. Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
  10. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  11. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  12. Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).
  13. Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
  14. Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
  15. Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
  16. Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
  17. Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).

Play Video

Cite This Article
Shandra, O., Robel, S. Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (156), e60360, doi:10.3791/60360 (2020).

View Video