Summary

Induzir epilepsia pós-traumática em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática difusa repetitiva

Published: February 10, 2020
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Summary

Este protocolo sistemático descreve um novo modelo animal de epilepsia pós-traumática após lesão cerebral traumática repetitiva. A primeira parte detalha etapas para indução traumática de lesão cerebral usando um modelo modificado de queda de peso. A segunda parte fornece instruções sobre a abordagem cirúrgica para sistemas de aquisição de dados eletroencefalográficos de um único e multicanal.

Abstract

Lesão cerebral traumática (TBI) é uma das principais causas de epilepsia adquirida. O TBI pode resultar em uma lesão cerebral focal ou difusa. A lesão focal é resultado de forças mecânicas diretas, às vezes penetrando pelo crânio, criando uma lesão direta no tecido cerebral. Estes são visíveis durante a imagem cerebral como áreas com contusão, laceração e hemorragia. Lesões focais induzem a morte neuronal e a formação de cicatrizes gliais e estão presentes em 20%-25% de todas as pessoas que incorrem em um TCE. No entanto, na maioria dos casos de TBI, a lesão é causada por forças de aceleração-desaceleração e posterior escofeteca de tecido, resultando em danos não focais e difusos. Uma subpopulação de pacientes com TBI continua a desenvolver epilepsia pós-traumática (EPT) após um período de latência de meses ou anos. Atualmente, é impossível prever quais pacientes desenvolverão PTE, e as convulsões em pacientes com PTE são desafiadoras de controlar, necessitando de mais pesquisas. Até recentemente, o campo se limitava a apenas dois modelos de animais/roedores com convulsões pós-traumáticas validadas, ambos apresentando grandes lesões focais com perda maciça de tecido no córtex e às vezes estruturas subcorticais. Ao contrário dessas abordagens, foi determinado que o TBI difuso induzido usando um modelo modificado de queda de peso é suficiente para iniciar o desenvolvimento de convulsões convulsivas espontâneas e não convulsivas, mesmo na ausência de lesões focais ou perda de tecido. Semelhante a pacientes humanos com epilepsia pós-traumática adquirida, este modelo apresenta um período de latência após lesão antes do início da convulsão. Neste protocolo, a comunidade receberá um novo modelo de epilepsia pós-traumática, detalhando como induzir TBI difuso não-lesão seguido de monitoramento contínuo de animais eletroencefalográficos de vídeo a longo prazo ao longo de vários meses. Este protocolo detalhará o manuseio de animais, o procedimento de queda de peso, a colocação de eletrodos para dois sistemas de aquisição e os desafios frequentes encontrados durante cada uma das etapas de cirurgia, monitoramento pós-operatório e aquisição de dados.

Introduction

Todos os anos, a TBI afeta cerca de 60 milhões de pessoas em todo o mundo. Indivíduos impactados têm maior risco de desenvolver epilepsia, o que pode se manifestar anos após a lesão inicial. Embora os TBIs graves estejam associados a um maior risco de epilepsia, mesmo o TBI leve aumenta a chance de um indivíduo desenvolver epilepsia1,2,3,4. Todos os TBIs podem ser classificados como focas, difusos ou uma combinação de ambos. A lesão cerebral difusa, presente em muitos, se não todos os TBIs, é resultado de tecidos cerebrais de diferentes densidades se escorando uns contra os outros devido à aceleração-desaceleração e forças rotacionais. Por definição, a lesão difusa só ocorre isoladamente em lesão cerebral leve/concussiva, na qual não há lesões cerebrais visíveis em tomografiacomputadorizadacomputadorizada 5.

Atualmente, há dois problemas críticos no manejo de pacientes que têm, ou estão em risco de desenvolver epilepsia pós-traumática (PTE). A primeira é que, uma vez manifestado pelo PTE, as apreensões são resistentes às drogas antiepilépticas disponíveis (AEDs)6. Em segundo lugar, os AEDs são igualmente ineficazes na prevenção da epilepileptogênese, e não há abordagens terapêuticas alternativas eficazes. Para enfrentar esse déficit e encontrar melhores metas terapêuticas e candidatos ao tratamento, será necessário explorar novos mecanismos celulares e moleculares na raiz do PTE6.

Uma das características proeminentes da epilepsia pós-traumática é o período latente entre o evento traumático inicial e o início de convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes. Os eventos que ocorrem dentro dessa janela temporal são um foco natural para os pesquisadores, pois desta vez a janela pode permitir o tratamento e a prevenção do PTE completamente. Os modelos animais são mais utilizados para esta pesquisa porque oferecem vários benefícios distintos, e não menos importante é que o monitoramento contínuo de pacientes humanos seria ao mesmo tempo impraticável e caro ao longo de tais períodos potencialmente longos de tempo. Além disso, mecanismos celulares e moleculares na raiz da epileptogênese só podem ser explorados em modelos animais.

Modelos animais com convulsões pós-traumáticas espontâneas e epilepsia são preferidos em modelos onde as convulsões são induzidas após o TBI por meios menos fisiologicamente relevantes, como por quimioconvulsivos ou estimulação elétrica agudamente, cronicamente ou por acender. Modelos espontâneos de convulsão pós-traumática testam como o TBI modifica a rede cerebral saudável que leva à epilofegênese. Estudos utilizando estimulação adicional após o TBI avaliar como a exposição ao TBI reduz o limiar de convulsão e afeta a suscetibilidade às convulsões. As vantagens dos modelos animais com convulsões induzidas quimicamente ou com estimulação elétrica estão em testar os mecanismos específicos de refratividade aos AEDs e a eficácia dos AEDs existentes e novos. No entanto, o grau de relevância e tradução desses dados para humanos pode ser ambíguo7 devido ao seguinte: 1) mecanismos de apreensão podem ser diferentes daqueles induzidos apenas pelo TBI; 2) nem todos esses modelos levam a convulsões espontâneas7; 3) lesões criadas pelo próprio agente convulsivo, com a cânula necessária para sua entrega, ou estimulando a colocação de eletrodos em estruturas de profundidade (por exemplo, o hipocampo ou amilgdala) já podem causar maior suscetibilidade de convulsões e até mesmo potenciais de campo epilépformehipo7. Além disso, alguns agentes convulsivos (ou seja, ácido kainic) produzem lesões hipocampais diretas e esclerose, o que não é típico após tbi difuso.

Até recentemente, existiam apenas dois modelos animais de epilepsia pós-traumática: impacto cortical controlado (CCI, focal) ou lesão de percussão fluida (FPI, focal e difusa)8. Ambos os modelos resultam em grandes lesões focais ao lado da perda de tecido, hemorragia e gliose em roedores8. Esses modelos imitam epilepsia pós-traumática induzida por grandes lesões focais. Um estudo recente demonstrou que o TBI difuso repetido (3x) é suficiente para o desenvolvimento de convulsões espontâneas e epilepsia em camundongos mesmo na ausência de lesões focais9,adicionando um terceiro modelo de PTE roedor com convulsões espontâneas confirmadas. Este novo modelo imita mudanças celulares e moleculares induzidas pelo TBI difuso, representando melhor a população humana com TBIs leves e concussivos. Nesse modelo, o período latente de três semanas ou mais antes do início da convulsão e o surgimento de convulsões tardias, espontâneas e recorrentes permite investigar as causas básicas da epileptogênese pós-traumática, testando a eficácia de abordagens preventivas e novos candidatos terapêuticos após o início da convulsão, e tem potencial para o desenvolvimento de biomarcadores de epileptogênese pós-traumática porque aproximadamente metade dos animais desenvolvem epilepsia pós-traumática.

A escolha do modelo animal para o estudo da epilepsia pós-traumática depende da questão científica, do tipo de lesão cerebral investigada e de quais ferramentas serão usadas para determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes. Em última análise, qualquer modelo de epilepsia pós-traumática deve demonstrar tanto o surgimento de convulsões espontâneas após o TBI quanto um período inicial de latência em um subconjunto de animais TBI, porque nem todos os pacientes que incorrem em um TBI passam a desenvolver epilepsia. Para isso, a eletroencefalografia (EEG) com aquisição simultânea de vídeo é utilizada neste protocolo. Entender os aspectos técnicos por trás do hardware e abordagens de aquisição de dados é fundamental para uma interpretação precisa dos dados. Os aspectos críticos do hardware incluem o tipo de sistema de gravação, tipo de eletrodos (parafuso ou suporte de arame) e material de que são feitos, aquisição sincronizada de vídeo sincronizado (como parte do sistema EEG ou terceiros) e propriedades do sistema de computador. É imprescindível definir os parâmetros de aquisição adequados em qualquer tipo de sistema, dependendo da meta de estudo, eventos de interesse eEG, método de análise adicional e sustentabilidade do armazenamento de dados. Por fim, o método de configuração de eletrodos (montagem) deve ser considerado, pois cada um tem vantagens e desvantagens e afetará a interpretação dos dados.

Este protocolo detalha como usar o modelo de queda de peso marmarou modificado10,11 para induzir lesões difusas resultando em convulsões espontâneas, não provocadas e recorrentes em camundongos, descreve abordagens cirúrgicas para adquirir um EEG de vídeo contínuo e multicanal único e sincronizado usando a montagem monopolar, bipolar ou mista.

Protocol

Todos os procedimentos em animais descritos neste protocolo foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e em conformidade com o ‘Guia para o Cuidado e Uso de Animais De Laboratório’ dos Institutos Nacionais de Saúde. . 1. Protocolo de manuseio de animais NOTA: Este protocolo destina-se a habituar animais encomendados de um fornecedor para a instalação após a chegada e condicioná-los a serem manusea…

Representative Results

O protocolo aqui descrito descreve o método de indução de uma lesão difusa isoladamente (por exemplo, na ausência de uma lesão focal) utilizando um modelo de camundongo de TBI difuso repetitivo (Figura 1). A Figura 1A retrata o dispositivo de queda de peso e seus componentes (Figura 1A, a1-a5) usadopara indução de TBI neste modelo e passos cruciais durante o procedimento (<strong class="xfig…

Discussion

Em contraste com os modelos CCI e FPI induzindo ou focal ou combinação de lesão focal e difusa, o modelo de TBI difuso repetitivo descrito neste protocolo permite a indução de lesão difusa na ausência de lesão cerebral focal e não requer aberturas de couro cabeludo ou craniana e a inflamação associada. Um benefício adicional da ausência de craniectomia neste modelo é que ele permite não só implantar os eletrodos para gravação crônica contínua de EEG, mas também a criação de uma janela craniana de c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/Estados Unidos e CURE com base em uma cura concedida recebida do Comando de Pesquisa Médica do Exército dos Estados Unidos e do Comando Materiel, Departamento de Defesa (DoD), através do Programa de Pesquisa em Saúde Psicológica e Lesão Cerebral Traumática o Prêmio Nº. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek é muito apreciado por revisar o manuscrito.

Materials

0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8209 0.10 inch long stainless steel
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8403 0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8212 0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA MS333/8-A/SPC 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8201 2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide Pharmacy
3EEG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8235-SM-C custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
C57BL/6 mice Harlan/Envigo Laboratories Inc male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory male, 12-16 weeks old
Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357 NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic Pharmacy
Dental cement and solvent kit Stoelting Co., USA 51459
Drill Foredom HP4-917
Drill bit Meisinger USA, LLC, USA HM1-005-HP 0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer Cellpoint Scientific, USA Germinator 500
EEG System 1 Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2 Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70% VWR, USA 71001-652 KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment Pro Labs Ltd, USA Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Hair removal product Church & Dwight Co., Inc., USA Nair cream
Isoflurane MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Povidone-iodine surgical solution Purdue Products, USA 004677 Betadine
Rimadyl/Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357
Solder Harware store
Soldering iron Weller, USA WP35 ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads Fisher Scientific, USA 22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads Cardinal Health, USA 3520
Tissue adhesive 3M Animal Care Products, USA 1469SB

References

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Cite This Article
Shandra, O., Robel, S. Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (156), e60360, doi:10.3791/60360 (2020).

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