環境と肥満相互作用のモデルとしての塩化ビニルと高脂肪食

動物/VC実験はすべて環境衛生省によって承認され、実験動物ケアの安全衛生協会および手順は、地元の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. 精製・実験食への実験的セットアップと順応 C56Bl/6Jマウスの総数を決定する(1群当たり最小6-8匹)。注:各ダイエット群の動物はさらに暴露群に細分化されます。研究を計画する際には、必ず必要な動物の総数を考慮してください。 動物を識別し、重量を量る。これらのデータを記録します。 通常のチョウから精製低脂肪(LFD)または高脂肪食(HFD)に切り替えて、吸入実験を開始する1週間前にマウスを新しい食事に順応させます(タイムラインについては図1参照)。 食べ物と水のアドリビタムを提供します。ケージごとに与えられる食品を計量し、記録し、各給餌日に残りの食べ物を計量し、記録することによって、食品消費量を監視します。ケージあたり4匹のマウスを収容する場合は、週に2回約50gの食物を提供する。ケージあたり5匹のマウスを収容する場合は、週に2回約60gの食物を提供する。注:精製された食事の供給中に、マウスが十分なペレットを持っていることを確認するために、食品の量を毎日チェックする必要があります。ペレットが不十分な場合、マウスは食物を「買いだめ」し、摂取量を増やす傾向がある。さらに、特にHFDはLFDよりもはるかに崩壊する傾向が、同様の効果を引き起こす。 実験全体を通して動物を監視し、動物の健康が維持されていることを確認します。注:毎週の体重増加と食品消費量は、代謝モニタリングと一緒に、全体的な動物の健康の指標を提供するために行うことができます。 2. 塩化ビニル吸入暴露システム 注:「鼻のみ」から「全身」の暴露、手動から自動システムまで、複数の吸入暴露システムが市販されています。このグループによって以前に公開されたデータは、全身マニュアルシステム12、23、24から導出された。自動吸入暴露システムを示す図を図2に示す。 実験室と制御室の両方の希釈空気が、それぞれの流量測定装置に入る前に、高効率微粒子空気(HEPA)と活性炭ろ過、乾燥、圧力調整されていることを確認してください(マスフローコントローラ[MFC])]–実験室、ロタメータ制御室)。注:コントロールチャンバでは、ロータメータはマウスへの気流を調節します。空気はチャンバーの上部に入り、マウスの下を通過し、次いでマウスの下で排気され、化学フードに入る前にHEPAフィルターを通過する。温度および相対湿度(RH)は部屋の中で測定される。実験室では、希釈空気がVCタンクからの空気と混合される。どちらのフローも MFC で調整されます。2つの混合物の比率は、実験室内のVCの濃度を決定する。VCは異なる方向を指す7つのジェット機が付いている分散機を通して露出室の上部に入る。VC はマウスを通過し、ケージ ラックの下に配置された 12 個の別個のポートを通って排気されます。このチャンバー設計は、以前に25の均質な毒性濃度を提供することが示されている。 圧力、温度およびRHが実験および制御室の中から監視されることを確認する。 化学フードの排気領域に入る前にチャンバの排気がHEPAフィルター、CO2プローブ、活性炭フィルターを通過し、マウスが許容できる換気を受けられるようにCO2レベルが監視されていることを確認します。 カスタムソフトウェアを使用して、吸入暴露中に環境変数を変更、監視、記録します。注: 手動システムを使用する場合は、露出期間を通じて定期的に必要に応じて、手順 2.1-2.4 で説明した変数を監視およびキャリブレーションする必要があります。 3. 露出前のセットアップ 技術者の安全のために実験および制御室のすべての気流を消しなさい。 チャンバーごとに、チャンバードアを開き、排泄物鍋の上に吸収性寝具材料(吸収側アップ)を置きます。吸収性材料を濡らし、露光期間を通じて快適な湿度レベル(40-60%RH)を提供します。 チャンバー内のVCの所望の露出レベルを設定します。サブOSHAリミット濃度の場合は、VCの0.85 ppmを使用します。チャンバへのVC配信のソフトウェア管理、検出器ベースのフィードバック制御を使用するか、システムに手動調整を使用します。注:後者のアプローチは、チャンバ容積、チャンバーリフレッシュレート、気流および在庫供給からのVCガスの送達速度の知識を必要とします。これらの計算は、その後、定常状態12、24のチャンバ内のVC濃度の測定値によって検証され、較正されなければならない。チャンバー内のVCを測定するための最も一般的な技術は、サンプル空気12、24のガスクロマトグラフィー分析を介してである。VC配信の精度と精度に関するソフトウェア駆動型アプローチの利点は明らかです。しかし、手動アプローチも正確で一貫した12、24であることが示されている。注意:VCは、高レベルで既知の毒性および発癌物質である。チャンバーのオン/オフを切り離しながら、適切な個人的な保護装置とガスの取り扱いを行使してください。 4. 暴露ケージと動物の準備 ハウジングチャンバーからマウスを取り出し、吸入チャンバーケージラックの個々のケージに入れ(コントロールマウス用のケージラック1個、露出マウス用のケージラック)に入ります。ケージラック内の各マウスの配置を毎日ランダム化して、各マウスが露出室内で均一に露出されるようにします。各動物の番号とケージの配置位置を実験室ノートにマークします。 各ケージラックをそれぞれのチャンバーに入れ、チャンバードアを閉じます。 5. 露出の実施 VCガスタンクのバルブが開いた位置にあることを確認します。実験室の希釈流量が25 L/分に設定されていることを確認します。 実験室で希釈された流れを開始する。制御室のロータメータが25 L/minに設定されていることを確認します。 すべてのセンサー(流れ、温度、湿度、チャンバ圧力、CO2レベル)が正しく動作し、実験室と制御チャンバーの両方で期待される結果を表示していることを確認します。注: VC フローは、希釈されたフローと必要な VC 濃度に基づいて計算および設定されます。 露光全体を通して、実験室内で、露光時間、希釈流量、VCフロー、温度、湿度、チャンバ圧力、CO2レベル、および理論VC濃度が表示され、グラフ化され、記録されていることを確認します。制御室の温度と湿度も表示され、グラフ化され、記録されていることを確認します。メモ:手動システムを使用する場合は、露出期間を通じて、必要に応じてVCフローをチェックし、調整する必要があります。 露出中に問題が発生した場合は、VC フローをゼロに設定し、希釈流量を最大値に増やしてチャンバをすばやくパージします。 露光時間(6時間/日)に達すると、ソフトウェアはVCフローを自動的にオフにします。15分の安全タイマーは、その後、VCをクリアするために実験室のための持続後の時間のために開始します。動物を安全に取り除いたら、ダイアログボックスの「OK」ボタンをクリックします。システムは測定値の記録を停止し、露出は終了します。注: 手動システムを使用する場合、ユーザは露出時間の終了時にVCフローを手動でオフにし、露出終了時のVCクリアランスの時間を計算する必要があります。 6. 露出後 VCガスタンクのバルブのストップコックを閉じた位置に回し、露出室内のすべての気流をオフにします。制御室に気流が流れなくなるまでロータメータを回します。 各チャンバーからドアを取り外して、マウスに換気を与えます。ケージラックをチャンバーから取り外します。フードの下で、露出ケージからマウスを取り出し、ハウジングケージに戻します。すべてのマウスを定期的なケージに一晩住むハウジングのために彼らのハウジングルームに戻って輸送します。 排泄物鍋からの廃棄物は、機関の環境保健サービスによって化学的危険とみなされる可能性があるため、環境衛生安全省(DEHS)承認のバイオハザードコンテナに処分してください。実験および制御システムのためのチャンバードア、排泄鍋、露出ケージラックおよび露出室をきれいにしなさい。 7. 暴露中のチャンバー内のVC濃度の検証 各露光(3時間)の途中で実験室内のVC濃度の測定を行う。 VC検出器チューブとプリトリートチューブのガラスチップを破ります。VC検出器チューブのフローアウト端を検出器チューブポンプに取り付けます。VC検出器チューブのフローインエンドを、短いチューブでプリトリートチューブのフローアウトエンドに取り付けます。短いチューブをプリトリートチューブのフローインエンドに取り付けます。 マウスの呼吸ゾーンの近くにあるサンプリングポートの1つからプラグを取り外します。プリトリートチューブのフローインエンドからサンプリングポートにチューブを取り付けます。 フルインポジションから、検出器チューブポンプのピストン上のハンドルをフルアウト位置まで伸ばします。これは90 sの期間にわたってVC検出器の管にサンプリングされたガスの100 mLを引っ張る。90sを待った後、ハンドルを押し込み直します。 合計 400 mL が VC 検出器チューブに引き込られるように、手順 7.4 をさらに 3 回繰り返します。 チャンバーのサンプリングポートからチューブを取り外し、プラグをポートに挿入し直します。VC検出器チューブの色の変化を調べて、チャンバー内のVC濃度を確認します。 VC検出器チューブの読み取り値を実験室ノートに記録し、理論値と比較します。VC検出器チューブとプリトリートチューブを適切な容器に入れます。 8. 吸入暴露実験の終了 注:吸入暴露開始後6、8、または12週間後に所望の時間点が与えられると、実験は終了し、動物は安楽死させられます(タイムラインについては図1を参照)。 安楽死の時間の前にマウスを4時間速くする。注:この手順は、代謝分析のための空腹時血糖値とインスリンレベルの決定を可能にします。 麻酔の後に排泄を続ける米国獣医学会(AVMA)のガイドラインと一致する安楽死アプローチを使用してください。 各マウスに腹腔内注射によってケタミン/キシラジン(100/15 mg/kg)を投与し、麻酔を誘発する。注:塩化ビニル暴露がその有効性を妨げる可能性があるため、安楽死前の麻酔薬としてペントバルビタールナトリウムを避けてください。 下大静脈からクエン酸ナトリウム溶液(最終、0.38%)に血液を採取し、血液凝固を予防し、サンプル保存を行います。 肝臓や他の所望の臓器を削除します。液体窒素中の肝臓およびスナップ凍結部分を解剖し、凍結標本培地に埋め込み、10%緩衝ホルマリンをヒストロジー用に固定する。 遠心分離を介して血液から血漿を分離し、クイトプラズマを適切なチューブに移し、分析に必要になるまで-80°Cで保存します。 肝障害の組織学的指標を評価するには、5μMホルマリン固定パラフィン埋め込み肝臓切片でヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、明視野顕微鏡で画像を得る。 血漿トランスアミナーゼレベルを得るために、市販のキットを使用してシトレートプラズマ上でアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)運動性アッセイの両方を行います。注: 品質管理の場合、C57Bl/6J マウスの血漿トランスアミナスは LFD+VC グループの通常の範囲(35-45 IU/L)である必要がありますが、HFD+VC グループの値は高くする必要があります(図 3C)。