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Medicine

Vinylchlorid und fettreiche Ernährung als Modell der Umwelt- und Adipositas-Interaktion

Published: January 12, 2020
doi:
10.3791/60351
, , , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 2Hepatobiology and Toxicology Program,University of Louisville, 3Department of Physiology and Pharmacology,West Virginia University, 4Center for Inhalation Toxicology,West Virginia University, 5Department of Pharmacology and Chemical Biology,University of Pittsburgh, 6Pittsburgh Liver Research Center,University of Pittsburgh, 7Department of Medicine, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition,University of Pittsburgh

Summary

Das Ziel dieses Protokolls war es, ein murines Modell der low-level toxischen Exposition zu entwickeln, die keine overt Leberverletzung verursacht, sondern eher bereits bestehende Leberschäden verschärft. Dieses Paradigma rekapituliert besser die Exposition des Menschen und die subtilen Veränderungen, die bei der Exposition gegenüber toxischen Konzentrationen auftreten, die als sicher gelten.

Abstract

Vinylchlorid (VC), eine reichliche Umweltverunreinigung, verursacht Steatohepatitis auf hohem Niveau, gilt aber in niedrigeren Konzentrationen als sicher. Obwohl mehrere Studien die Rolle von VC als direktes Hepatoxikummittel untersucht haben, ist das Konzept, dass VC die Empfindlichkeit der Leber gegenüber anderen Faktoren, wie der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD), die durch fettreiche Ernährung (HFD) verursacht wird, neu. Dieses Protokoll beschreibt ein Expositionsparadigma zur Bewertung der Auswirkungen einer chronischen, niedrigen Exposition gegenüber VC. Mäuse werden eine Woche vor Beginn der Inhalationsexposition an fettarme oder fettreiche Ernährung geimpft und bleiben während des gesamten Experiments auf dieser Diät. Mäuse sind VC (Sub-OSHA-Niveau: <1 ppm) oder Raumluft in Inhalationskammern für 6 Stunden/Tag, 5 Tage/Woche, für bis zu 12 Wochen ausgesetzt. Tiere werden wöchentlich auf Körpergewichtszunahme und Nahrungsverzehr überwacht. Dieses Modell der VC-Exposition verursacht keine verdeckten Leberverletzungen mit VC-Inhalation allein. Jedoch, die Kombination von VC und HFD deutlich verbessert Lebererkrankungen. Ein technischer Vorteil dieses Co-Expositionsmodells ist die Ganzkörperbelichtung ohne Rückhalteeinrichtung. Darüber hinaus ähneln die Bedingungen eher einer sehr häufigen menschlichen Situation einer kombinierten Exposition gegenüber VC mit zugrunde liegender nichtalkoholischer Fettleber und stützen daher die neue Hypothese, dass VC ein Umweltrisikofaktor für die Entwicklung von Leberschäden als Komplikation von Fettleibigkeit (d. h. NAFLD) ist. Diese Arbeit stellt das Paradigma in Frage, dass die aktuellen Expositionsgrenzwerte von VC (beruflich und ökologisch) sicher sind. Die Verwendung dieses Modells kann ein neues Licht auf die Risiken einer VC-Exposition werfen. Dieses Modell der toxischen-induzierten Leberverletzung kann für andere flüchtige organische Verbindungen verwendet werden und andere Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Leber und andere Organsysteme beeinflussen können.

Introduction

Zahlreiche Giftstoffe sind in der Luft vorhanden, die wir in sehr niedrigen Konzentrationen atmen. Vinylchlorid (VC) ist monomeres Gas, das von der Industrie zur Herstellung von Polyvinylchlorid (PVC) Kunststoffprodukten verwendet wird1. Es ist ein weit verbreitetes Umwelthepatoxikanoxid, bekannt karzinogen, und wird #4 auf der ATSDR Hazardous Substance Priority List2. Um die toxischen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Wechselwirkungen mit bestehenden Komorbiditäten besser zu verstehen, ist es von entscheidender Bedeutung, Expositionsmodelle zu etablieren, die die Exposition des Menschen nachahmen. Das primäre Interesse dieser Gruppe ist es, die leberischen Auswirkungen der chronischen VC-Exposition bei niedrigen Konzentrationen zu untersuchen. VC übt seine Hauptwirkung auf die Leber aus, wo gezeigt wurde (bei hohen Konzentrationen), dass Steatose und toxische steatohepatitis (TASH) mit Nekrose, Fibrose, Zirrhose3,4, sowie hepatozellulärem Karzinom (HCC) und dem ansonsten extrem seltenen Hepatic-Hemangiosarkom5verursacht werden. TASH existiert wahrscheinlich in der Bevölkerung seit Jahrzehnten, blieb aber uncharakterisiert und von den Ermittlern unterschätzt4,6. Als Ergebnis von Untersuchungen, die die direkten Toxizitätsbedenken für eine VC-Exposition belegen, senkte die Occupational Safety and Health Administration (OSHA) den akzeptablen Expositionsgrenzwert über einen 8-Stunden-Arbeitstag7auf 1 ppm. Obwohl die Expositionsschwelle gesenkt wurde, ist die Wirkung dieser Konzentration von VC auf die menschliche Gesundheit unklar7. Darüber hinaus ist die Wirkung der VC-Exposition auf bestehende Komorbiditäten, wie Lebererkrankungen, weitgehend unbekannt8. Diese Wissenslücke ist heute besonders wichtig aufgrund der zunehmenden globalen Prävalenz von nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Wichtig ist, VC hat sich vor kurzem als ein unabhängiger Risikofaktor für Lebererkrankungen von anderen Ursachen13gezeigt. Ziel dieses Protokolls war es daher, ein relevantes Inhalationsmodell für die Exposition gegenüber dem flüchtigen Umweltgift VC im Zusammenhang mit zugrunde liegenden Leberverletzungen zu entwickeln, um die Exposition des Menschen nachzuahmen und mögliche, neuartige Mechanismen von VC-induzierten oder VC-verstärkten Leberverletzungen zu identifizieren.

Der Hauptweg der Exposition für viele Umweltgifte und Schadstoffe ist das Einatmen. Nach dem Einatmen kann die Verbindung durch die Lunge in den systemischen Kreislauf gelangen, in die Leber gelangen und durch Leberenzyme metabolisch aktiviert werden, bevor sie14,15,16ausgeschieden wird. Es sind oft diese aktiven Metaboliten, die Toxizität und Schäden im Körper verursachen. Frühere Studien dieser Gruppe und anderer haben VC-Metaboliten als Ersatz für die Exposition gegenüber VC-Gas17,18verwendet. Andere Gruppen haben Inhalationsmodelle von VC verwendet; jedoch wurden extrem hohe Expositionswerte (>50 ppm) implementiert, um akute Toxizität, schwere Leberschäden und Tumorentwicklung zu induzieren19. Obwohl diese Studien wichtige Informationen und Mechanismen der VC-induzierten Karzinogenität geliefert haben, rekapitulieren sie nicht die subtilen Effekte und komplexen Wechselwirkungen mit anderen beitragenden Faktoren und sind daher weniger relevant für die Exposition des Menschen.

Das hier beschriebene VC-Inhalation plus High Fat Eat (HFD)-Modell (siehe Abbildung 1 für die Zeitleiste) ist das erste Modell chronischer, niedrig dosierter VC-Exposition (d. h. Sub-OSHA-Konzentration), bei dem Mäuse unter Bedingungen, die die Exposition des Menschen viel genauer nachahmen, dem Toxikten ausgesetzt sind. Tatsächlich, Daten aus diesem Modell rekapitulierte Ergebnisse bei Menschen beobachtet VC, wie die Auswirkungen auf Stoffwechselwege20, oxidativer Stress und mitochondriale Dysfunktion4. Andere Mausmodelle der Inhalation, wie z. B. Kopf- und Nasenmodelle21, erfordern, dass das Tier zurückgehalten wird, was Stress für das Tier verursacht. Hier erfordert diese Ganzkörper-Expositionsmethode keine Injektion oder unnötigen Stress für die Tiere. Die Tiere haben ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und werden in der größeren Inhalationskammer für eine bestimmte Anzahl von Stunden pro Tag und Tag pro Woche platziert. Darüber hinaus ist das Konzept, dass VC die Empfindlichkeit gegenüber einem anderen Hepatoxikand verändert, ein neuartiger Befund, der zuerst von dieser Gruppe12 nachgewiesen wurde und Auswirkungen auf die VC-Exposition bei Konzentrationen hat, die weit unter denen liegen, die für eine direkte Hepatotoxizität erforderlich sind.

Diese Methode der Inhalationsexposition kann verwendet werden, um die Exposition gegenüber einer Vielzahl von gasförmigen Giftstoffen, einschließlich anderer flüchtiger organischer Verbindungen, in unserer Umwelt nachzuahmen. Tatsächlich sind flüchtige organische Verbindungen eine große Gruppe von Umweltgiftstoffen und in industrialisierten Gebieten häufiger verbreitet, was dazu führt, dass bestimmte Populationen einem höheren Risiko für chronische Exposition ausgesetzt sind22. Dieses Protokoll kann an verschiedene experimentelle Fragen angepasst werden. Die Dauer und Konzentration der verabreichten Verbindung kann variiert werden. Obwohl ursprünglich für die Bestimmung von Leberschäden entwickelt, können und wurden andere Organsysteme mit diesem Modelluntersucht 23. Forscher, die chronische Expositionen mit Tieren untersuchen, aber den Stress bei Tieren minimieren wollen, sollten dieses Modell in Betracht ziehen.

Protocol

Alle Tier-/VC-Experimente wurden vom Department of Environmental Health, der Safety Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt und die Verfahren wurden vom örtlichen Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung genehmigt. 1. Versuchsaufbau und Akklimatisierung an gereinigte, experimentelle Diäten Bestimmen Sie die Gesamtzahl der C56Bl/6J-Mäuse (minimal 6 x 8 Mäuse pro Gruppe).HINWEIS: Tiere jeder Ernährungsgruppe werden weiter in Expositionsgruppen unterteilt. Achten Sie darauf, die Gesamtzahl der Tiere zu berücksichtigen, die bei der Planung der Studie benötigt werden. Identifizieren und wiegen Sie die Tiere. Zeichnen Sie diese Daten auf. Wechseln Sie eine Woche vor Beginn der Inhalationsexperimente die Diäten von regulärem Chow auf gereinigte fettarme (LFD) oder fettreiche Ernährung (HFD), um die Mäuse an die neuen Diäten zu akklimatisieren (siehe Abbildung 1 für die Zeitleiste). Geben Sie Essen und Wasser ad libitum. Überwachen Sie den Lebensmittelverbrauch, indem Sie die lebensmittelgebende Nahrung pro Käfig wiegen und aufzeichnen und den Rest der Nahrung an jedem Fütterungstag wiegen und aufzeichnen. Wenn 4 Mäuse pro Käfig untergebracht sind, stellen Sie zweimal pro Woche 50 g Nahrung bereit. Wenn 5 Mäuse pro Käfig untergebracht sind, stellen Sie zweimal pro Woche 60 g Nahrung bereit.HINWEIS: Während der Fütterung der gereinigten Diäten sollte die Menge der Nahrung jeden Tag überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Mäuse über genügend Pellets verfügen. Wenn es nicht genügend Pellets gibt, neigen die Mäuse dazu, Nahrung zu “horten” und die Aufnahme zu erhöhen. Darüber hinaus neigt vor allem die HFD dazu, viel mehr zu bröckeln als die LFD, was einen ähnlichen Effekt verursacht. Überwachen Sie die Tiere während des gesamten Experiments, um die Gesundheit der Tiere zu gewährleisten.HINWEIS: Wöchentliche Gewichtszunahme und Nahrungsverbrauch, zusammen mit metabolischen Überwachung kann durchgeführt werden, um einen Index der allgemeinen Tiergesundheit zur Verfügung zu stellen. 2. Vinylchlorid-Inhalations-Expositionssystem HINWEIS: Es sind mehrere Inhalations-Expositionssysteme im Handel erhältlich, die von “Nase-only”-Exposition über “Ganzkörper”-Exposition und manuelle bis hin zu automatisierten Systemen reichen. Die zuvor von dieser Gruppe veröffentlichten Daten wurden von einem ganzheitigen manuellen Systemabgeleitet 12,23,24. Abbildung 2zeigt ein Diagramm, das das automatisierte Inhalationsexpositionssystem beschreibt. Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungsluft sowohl in den Versuchs- als auch in den Regelkammern hocheffiziente Partikelluft (HEPA) und Aktivkohle gefiltert, getrocknet und druckreguliert ist, bevor sie in ihre jeweiligen Durchflussmessgeräte (Massenstromregler [MFC) ]–Experimentelle Kammer, Rotameter-Kontrollkammer).HINWEIS: In der Steuerkammer reguliert das Rotameter den Luftstrom zu den Mäusen. Die Luft dringt in die Oberseite der Kammer ein, geht an den Mäusen vorbei, wird dann unter den Mäusen erschöpft und durch einen HEPA-Filter geleitet, bevor sie die chemische Haube betreten. Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit (RH) werden innerhalb der Kammer gemessen. In der Versuchskammer wird die Verdünnluft mit Luft aus einem VC-Tank vermischt. Beide Ströme werden mit MFCs reguliert. Das Verhältnis der beiden Mischungen bestimmt die Vc-Konzentration in der Versuchskammer. Die VC gelangt über einen Dispergierer mit sieben Düsen, die in verschiedene Richtungen zeigen, in die Oberhälfte der Belichtungskammer. Die VC geht an den Mäusen vorbei und wird dann durch 12 separate Ports, die unter dem Käfiggestell positioniert sind, erschöpft. Dieses Kammerdesign liefert nachweislich homogene toxische Konzentrationen von bisher25. Stellen Sie sicher, dass Druck, Temperatur und RH aus den Versuchs- und Regelkammern heraus überwacht werden. Bestätigen Sie, dass der Kammerauspuff durch einen HEPA-Filter, eineCO2-Sonde und einen Aktivkohlefilter geleitet wird, bevor er in den Abgasbereich der chemischen Haube eintritt, und dass derCO2-Gehalt überwacht wird, um sicherzustellen, dass die Mäuse eine akzeptable Belüftung erhalten. Verwenden Sie die benutzerdefinierte Software, um Umgebungsvariablen während der Inhalationsexposition zu ändern, zu überwachen und aufzuzeichnen.HINWEIS: Wenn ein manuelles System verwendet wird, sollten die in den Schritten 2.1 bis 2.4 beschriebenen Variablen überwacht und kalibriert werden, wenn dies während des gesamten Expositionszeitraums regelmäßig erforderlich ist. 3. Vorbelichtung Schalten Sie alle Luftströme in den Versuchs- und Steuerkammern aus, um die Sicherheit der Techniker zu gewährleisten. Öffnen Sie für jede Kammer die Kammertür und legen Sie saugfähiges Einstreumaterial (absorbierende Seite nach oben) auf die Ausscheidungspande. Befeuchten Sie das saugfähige Material, um während des gesamten Expositionszeitraums eine angenehme Luftfeuchtigkeit (40 bis 60 % RH) zu gewährleisten. Stellen Sie den gewünschten Belichtungsgrad von VC in der Kammer ein. Für Sub-OSHA-Grenzwerte verwenden Sie 0,85 ppm VC. Verwenden Sie entweder die softwaregesteuerte, detektorbasierte Rückkopplungssteuerung der VC-Bereitstellung an die Kammer oder manuelle Anpassungen am System.ANMERKUNG: Letzterer Ansatz erfordert Kenntnisse des Kammervolumens, der Kammerauffrischungsrate, des Luftstroms und der Förderrate des VC-Gases aus der Lagerzufuhr; diese Berechnungen müssen anschließend durch Messungen der VC-Konzentrationen in der Kammer bei stationärem Zustand12,24validiert und kalibriert werden. Die häufigste Technik zur Messung von VC in der Kammer ist die gaschromatographische Analyse der Probenluft12,24. Die Vorteile des softwaregesteuerten Ansatzes in Bezug auf Genauigkeit und Genauigkeit der VC-Bereitstellung liegen auf der Hand. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der manuelle Ansatz auch korrekt und konsistent ist12,24.VORSICHT: VC ist ein bekanntes Toxisches und karzinogen es in hohen Konzentrationen. Trainieren Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung und den Umgang mit dem Gas beim Ein- und Ausschalten der Kammern. 4. Expositionskäfig und Tierzubereitung Entfernen Sie die Mäuse aus ihren Gehäusekammern und legen Sie sie in die einzelnen Käfige des Inhalationskammerkäfigs (ein Käfigträger für die Kontrollmäuse, einer für die exponierten Mäuse). Randomisieren Sie die Platzierung jeder Maus innerhalb des Käfiggestells täglich, um sicherzustellen, dass jede Maus homogen innerhalb der Belichtungskammer ausgesetzt wird. Markieren Sie die Nummer und die Position des Käfigs jedes Tieres im Labor-Notebook. Legen Sie jedes Käfiggestell in seine jeweilige Kammer und schließen Sie die Kammertüren. 5. Durchführung einer Exposition Stellen Sie sicher, dass sich das Ventil für den VC-Gastank in der offenen Position befindet. Stellen Sie sicher, dass der Verdünnungsfluss für die Versuchskammer auf 25 L/min eingestellt ist. Starten Sie den Verdünnerfluss in der Versuchskammer. Stellen Sie sicher, dass das Rotameter an der Steuerkammer auf 25 l/min eingestellt ist. Stellen Sie sicher, dass alle Sensoren (Ströme, Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Kammerdruck,CO2-Pegel) korrekt funktionieren und die erwarteten Ergebnisse sowohl in den Versuchs- als auch in den Regelkammern anzeigen.HINWEIS: Der VC-Fluss wird basierend auf dem Verdünnungsfluss und der gewünschten VC-Konzentration berechnet und eingestellt. Stellen Sie sicher, dass während der gesamten Exposition, in der Versuchskammer, die Belichtungszeit, der Verdünnungsfluss, der VC-Fluss, die Temperatur, die Luftfeuchtigkeit, der Kammerdruck, derCO2-Gehalt und die theoretische VC-Konzentration angezeigt, grafisch dargestellt und aufgezeichnet werden. Bestätigen Sie, dass die Temperatur und Luftfeuchtigkeit für die Steuerkammer ebenfalls angezeigt, grafisch dargestellt und aufgezeichnet werden.HINWEIS: Wenn ein manuelles System verwendet wird, sollte der VC-Fluss während des gesamten Belichtungszeitraums überprüft und bei Bedarf angepasst werden. Wenn während der Belichtung Probleme auftreten, stellen Sie den VC-Fluss auf Null ein und erhöhen Sie den Verdünnungsfluss auf den maximalen Wert, um die Kammer schnell zu reinigen. Sobald die Belichtungsdauer (d. h. 6 h/Tag) erreicht ist, schaltet die Software den VC-Fluss automatisch aus. Der 15 min Sicherheitstimer beginnt dann für die Zeit nach der Dauer für die Versuchskammer, um die VC zu löschen. Sobald es sicher ist, die Tiere zu entfernen, klicken Sie auf die Schaltfläche OK im Dialogfeld. Das System stoppt die Aufzeichnung von Messungen in der Datei und die Belichtung ist beendet.HINWEIS: Wenn ein manuelles System verwendet wird, muss der Benutzer den VC-Fluss am Ende der Belichtungsdauer manuell ausschalten, und die Zeit für die VC-Freigabe am Ende der Belichtung muss berechnet werden. 6. Nachderinstand Drehen Sie den Hahn am Ventil für den VC-Gastank in die geschlossene Position und schalten Sie alle Luftströme in der Belichtungskammer aus. Drehen Sie das Rotameter, bis kein Luftstrom durch die Kontrollkammer fließt. Entfernen Sie die Türen aus jeder Kammer, um die Mäuse zu belüften. Entfernen Sie die Käfigträger aus den Kammern. Entfernen Sie die Mäuse unter einer Kapuze aus ihren Expositionskäfigen und legen Sie sie wieder in ihre Gehäusekäfige. Transportieren Sie alle Mäuse zurück in ihren Wohnraum für Übernachtungsmöglichkeiten in regulären Käfigen. Entsorgen Sie alle Abfälle aus der Ausscheidungspfanne in einen vom Department of Environmental Health & Safety (DEHS) zugelassenen Biogefährdungsbehälter, da diese von institutionellen Umweltgesundheitsdiensten als chemische Gefahr angesehen werden können. Reinigen Sie die Kammertüren, die Ausscheidungswanne, den Belichtungskäfigund die Belichtungskammer für die Versuchs- und Steuerungssysteme. 7. Validierung der VC-Konzentration in Kammern während der Exposition Führen Sie eine Messung der VC-Konzentration innerhalb der Versuchskammer auf halbem Weg durch jede Exposition (3 h) durch. Brechen Sie die Glasspitzen auf einem VC-Detektorrohr und einem Pretreat-Rohr. Befestigen Sie das Ausflussende des VC-Detektorrohrs an der Detektorrohrpumpe. Befestigen Sie das Einflussende des VC-Detektorrohrs mit einem kurzen Rohrstück am Ausflussende des Pretreat-Rohrs. Befestigen Sie ein kurzes Stück Schläuche am Einflussende des Pretreat-Rohrs. Entfernen Sie einen Stecker von einem der Probenahmeanschlüsse, der sich in der Nähe der Atemzone der Mäuse befindet. Befestigen Sie die Schläuche vom Einflussende des Pretreat-Rohrs an den Probenahmeanschluss. Von der vollen Position aus, verlängern Sie den Griff auf dem Kolben der Detektorrohrpumpe bis zur vollen Out-Position. Dadurch werden über einen Zeitraum von 90 s 100 ml abgetastetes Gas aus der Kammer in das VC-Detektorrohr gezogen. Nachdem Sie die 90er jahre gewartet haben, drücken Sie den Griff wieder hinein. Wiederholen Sie Schritt 7.4 noch dreimal, so dass insgesamt 400 ml in das VC-Detektorrohr gezogen werden. Entfernen Sie das Rohr aus dem Abtastanschluss der Kammer, und setzen Sie den Stecker wieder in den Anschluss ein. Prüfen Sie den Farbwechsel des VC-Detektorrohrs, um die VC-Konzentration in der Kammer zu ermitteln. Zeichnen Sie den VC-Detektorrohr-Messwert im Labor-Notebook auf und vergleichen Sie ihn mit dem theoretischen Wert. Entsorgen Sie das VC-Detektorrohr und das Pretreat-Rohr in einem geeigneten Behälter. 8. Beendigung des Inhalations-Expositionsexperiments HINWEIS: Nach dem gewünschten Zeitpunkt der Exposition, z. B. 6, 8 und/oder 12 Wochen nach Beginn der Inhalationsexposition, werden die Versuche beendet und die Tiere eingeschläfert (siehe Abbildung 1 für die Zeitleiste). Fasten Sie die Mäuse 4 h vor der Zeit der Euthanasie.HINWEIS: Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung des Fastenblutzucker- und Insulinspiegels für die metabolische Analyse. Verwenden Sie einen Euthanasie-Ansatz, der mit den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) übereinstimmt, wie z. B. Anästhesie, gefolgt von Exsanguination. Ketamin/Xylazin (100/15 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion an jede Maus verabreichen, um Anästhesie zu induzieren.HINWEIS: Vermeiden Sie Natriumpentobarbital als Anästhetikum vor der Euthanasie, da die Exposition aufgrund von Vinylchlorid seine Wirksamkeit beeinträchtigen kann. Sammeln Sie Blut aus der unteren Vena cava in Natriumcitratlösung (endend, 0,38%), um die Blutgerinnung zu verhindern und zur Probenkonservierung. Entfernen Sie die Leber und/oder ein anderes gewünschtes Organ. Sezieren Sie die Leber und Snap-Freeze-Teile in flüssigem Stickstoff, einbetten in gefrorenes Probenmedium, und fixieren in 10% gepuffertes Formalin für die Histologie. Plasma über Zentrifugation vom Blut trennen und das Citrated Plasma in eine geeignete Röhre geben und bei -80 °C lagern, bis es für die Analyse benötigt wird. Um histologische Indizes von Leberverletzungen zu bewerten, führen Sie Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) mit 5 M formalin fixierten Leberabschnitten durch und erhalten Bilder mit einem Hellfeldmikroskop. Um Plasmatransaminase-Spiegel zu erhalten, führen Sie sowohl Alanin-Aminotransferase (ALT) als auch Aspartat-Aminotransferase (AST) kinetische Assays auf das zitratierte Plasma mit handelsüblichen Kits durch.HINWEIS: Zur Qualitätskontrolle sollten Plasmatransaminasen für C57Bl/6J-Mäuse im Normalbereich (35-45 I.E./L) für die LFD+VC-Gruppe liegen, während die Werte für die HFD+VC-Gruppe erhöht werden sollten(Abbildung 3C).

Representative Results

Im Laufe des Experiments wurden das Körpergewicht der Tiere und der Nahrungsverbrauch wöchentlich überwacht, um die Tiergesundheit zu gewährleisten und den In-vivo-Stoffwechsel zu bewerten. Abbildung 3A zeigt Körpergewicht und Lebensmittelverbrauch für ein 12-wöchiges Experiment. Das Körpergewicht wurde einmal pro Woche und der Nahrungsverbrauch zweimal pro Woche für alle Gruppen gemessen. Alle Mäuse gewannen im Laufe der Studie an Gewicht. Während die Mäuse in den HFD-Gruppen erwartungsgemäß mehr Gewicht gewannen als die Mäuse in den LFD-Gruppen, gewannen die VC-exponierten Mäuse nicht mehr Gewicht als die Mäuse in der jeweiligen Kontrollgruppe. Der Nahrungsmittelverbrauch war nicht in allen Gruppen12,24unterschiedlich. Abbildung 3B zeigt repräsentative Photomikroskope von Leberabschnitten, die mit H&E zur Analyse der allgemeinen Morphologie befleckt sind. In der LFD-Gruppe verursachte VC keine unüben pathologischen Veränderungen. HFD-Fütterung signifikant erhöhte Steatose (Fettansammlung) und VC-Exposition erhöhte diesen Effekt. Darüber hinaus führte die VC-Exposition in der HFD-Gruppe zu einigen entzündlichen Brennpunkten12,24. Plasmatransaminase (ALT und AST) Ebenen wurden als Indikatoren für Leberschäden gemessen und ein erhöhter Transaminase-Spiegel ist ein Indikator für Leberschäden. In der LFD-Gruppe stieg die Transaminase nicht durch VC. HFD allein leicht erhöhte Transaminase-Spiegel und vor allem VC deutlich verbessert diesen Effekt (Abbildung 3C)12,24. Für jede Gruppe wurden lebergewichts- und körpergewichtsquotge Verhältnisse berechnet. HFD erhöhte signifikant das Verhältnis von Leber zu Körpergewicht. VC hat diesen Effekt jedoch nicht signifikant erhöht (Abbildung 3D)12. Abbildung 1: Übersicht über das Inhalationsmodellverfahren. Mäuse werden mit den jeweils fettarmen (13% gesättigten Fettsäuren) oder fettreichen (42% gesättigten Fettsäuren) Diäten ad libitum für 1 Woche gefüttert, um sie an die gereinigte Ernährung zu gewöhnen. Nach einer Woche werden Mäuse in das Inhalationsschema eingeführt. Dazu werden Mäuse in modernsten Ganzkörper-Inhalationskammern für eine Exposition gegenüber einer VC-Konzentration des Sub-OSHA-Niveaus von <1 ppm (0,85 ppm bei 0,1 ppm) oder Raumluft (Kontrolle) für 6 h/Tag, 5 Tage/Woche, für 12 Wochen platziert. Während des Inhalationsvorgangs haben die Mäuse freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Nach 12 Wochen werden Mäuse morgens eingeschläfert. Dieses Modell kann auf längere Zeiträume chronischer Exposition erweitert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Inhalationskammerdesign. Gezeigt wird ein Diagramm eines automatisierten Inhalationsexpositionssystems, das homogene toxische Konzentrationen liefert. Mit der benutzerdefinierten Software kann der Benutzer Umgebungsvariablen während der Inhalationsbelichtung ändern, überwachen und aufzeichnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Vinylchlorid allein verursacht keine verdeckten Leberschäden, sondern verbessert die ernährungsbedingte Lebererkrankung. (A) Körpergewicht und Lebensmittelverbrauch wurden wöchentlich überwacht. (B) Repräsentative Photomikroskope der allgemeinen Lebermorphologie durch H&E-Färbung werden gezeigt (Vergrößerung = 200x). (C) Citriertes Plasma wurde am Ende des Expositionszeitraums gesammelt und als Index der Leberschäden auf transaminase enzymatische Aktivität analysiert. (D) Das Lebergewicht wurde zu verschiedenen Versuchszeitpunkten bestimmt und mit dem Gesamtgewicht verglichen. Die Ergebnisse werden im Vergleich zur jeweiligen LFD-Steuerung als Mittelwert – SEM.a, p < 0,05 dargestellt; b, p < 0,05 im Vergleich zum Fehlen von VC. Stichprobengröße pro Gruppe n = 8 x 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Modell der VC-verstärkten NAFLD ist eine neuartige Methode, um die Wirkung der Sub-OSHA-Grenzwert VC-Exposition in einem Ganzkörper-Inhalationsparadigma zu bewerten. Dieses Modell ermöglicht es den Forschern, die subhepatotoxischen und sensibilisierenden Effekte durch niedrige VC-Werte allein zu untersuchen. Tatsächlich erreicht dieses Ko-Expositionsmodell eine verbesserte Leberverletzung, die Erhöhung von Plasma ALT und AST und eine moderate Entzündung, während es andere Organsysteme, wie das Herz, bei dieserKonzentrationweitgehend nicht betrifft. Dieses chronische Modell erfordert Ganzkörper-Inhalationskammern, minimiert aber Stress- und Expositionskonzentrationen. Obwohl das hier vorgestellte Protokoll ein softwaregesteuerter Ansatz ist, haben unsere Erfahrungen gezeigt, dass der manuelle Ansatz auch eine genaue und konsistente Methode der Belichtung12,24ist. Darüber hinaus ist es leicht anwendbar auf mehrere Forschungsbereiche einschließlich anderer Organschäden23 durch flüchtige organische Verbindung Expositionverursacht 22. Insbesondere könnte dieses Modell eher der Pathogenese menschlicher Koexpositionen gegenüber Umweltchemikalien und der zugrunde liegenden Krankheitähneln 5.

Um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, müssen bestimmte kritische Schritte der Protokolloptimierung erreicht werden. Die Prüfer müssen beispielsweise feststellen, dass die Konzentration von VC oder anderen toxischen Mittel in den Kammern innerhalb des gewünschten Expositionsbereichs liegt (d. h. niedrige, sub-OSHA oder akute Werte). Die Optimierung dieses Schritts der Inhalationskammer ist entscheidend für ein erfolgreiches Modell der menschlichen Interessenexposition. Zweitens kann auch die Anpassung der Expositionszeit pro Tag und der Dauer des Versuchs geändert werden. Gemäß den Interessen dieser Gruppe wurde eine berufliche Expositionseinstellung erreicht, und es wurde auch ein zusätzlicher Parameter der Ernährung untersucht. Umwelt- und akute Expositionen können jedoch auch mit diesem Protokoll modelliert werden.

Diese Arbeit stellt das Paradigma in Frage, dass die aktuellen Expositionsgrenzwerte von VC (beruflich und ökologisch) sicher sind. Obwohl der derzeitige OSHA-Expositionsgrenzwert für VC 1 ppm beträgt, hat dieses Modell bewiesen, dass VC-Konzentrationen unterhalb dieses Grenzwerts ausreichen, um Leberverletzungen zu verbessern, die durch HFD bei Mäusen verursacht werden. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, ein neuartiges toxisches Expositionsparadigma zu untersuchen und zu charakterisieren und TASH zu modellieren.

Dies ist das erste Modell der chronischen, niedrig dosierten VC-Exposition. Frühere Arbeiten verwendeten sehr hohe Boluskonzentrationen, akute Expositionen oder aktive Metaboliten als Ersatz für VC-Exposition. All diese Ansätze verringern die Relevanz der Befunde für die Exposition des Menschen. Daher bietet dieses neuartige Modell der TASH-NAFLD-Interaktion die notwendige Plattform für Die Forscher, um komplexe Wechselwirkungen von geringer VC-Exposition zu untersuchen.

Dieses Modell der toxischen-induzierten Leberverletzung kann für andere flüchtige organische Verbindungen verwendet werden und auch andere Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Leber und andereOrgansysteme8,22,23beeinflussen können. Darüber hinaus wurde und kann dieses Modell weiter verwendet werden, um Interventionstherapien und eingehende mechanistische Studien über die Wirkungsweise für dieses vorherrschende toxische Mittel zu untersuchen24. Da VC ein bekanntes Karzinogen26,27,28ist, kann dieses Expositionsparadigma auch für die Untersuchung von VC-induziertem Krebs modifiziert werden. Andere Komorbiditäten wie alkoholische Lebererkrankungen können auch durch VC-Ko-Exposition verstärkt werden. Darüber hinaus wäre es von Interesse, verschiedene Arten von Fett zu studieren, wie mehrfach ungesättigte Fettsäuren18,29,30, oder verschiedene Arten von Kohlenhydraten31 und ihre Ko-Exposition mit VC in diesem Modell. In der Tat, alle diese Faktoren sind bekannt, dass unterschiedliche Auswirkungen auf die Entwicklung von Leberschäden haben und kann eine Rolle bei VC-induzierten Lebererkrankungen spielen.

Zusammenfassend ist dies ein neuartiges Inhalationsmodell für umwelttoxische Leberschäden und etabliert ein Expositionsparadigma für chronische, niedrige VC-Exposition. Die Konzentration von VC in diesem Modell verwendet wird, ist subhepatotoxisch von selbst, während es Leberverletzungen durch einen anderen Faktor (HFD) bei Mäusen verursacht verbessert. Dieses Modell wird es den Forschern ermöglichen, Mechanismen und Interventionen für chronische VC-Toxizität zu untersuchen, und kann für translationale Studien hilfreich sein, die exponierte menschenausgesetzte Probanden untersuchen und das höchste Expositionsrisiko aufweisen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch Auszeichnungen der National Institutes of Health (K01 DK096042 und R03 DK107912) an Juliane Beier finanziert. Die Forschung wurde auch durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM113226 und des National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism of the National Institutes of Health unter der Award-Nummer P50AA024337. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materials

ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution
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References

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).
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