Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Tino  Emanuele Poloni; Valentina Medici; Arenn Faye Carlos; Annalisa Davin; Arcangelo Ceretti; Michela Mangieri; Paola Cassini; Roberta Vaccaro; Daniele Zaccaria; Simona Abbondanza; Matteo Bordoni; Valentina Fantini; Elena Fogato; Cristina Cereda; Mauro Ceroni; Antonio Guaita

doi:10.3791/60296

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Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

Published: June 03, 2020

doi:

10.3791/60296

Tino Emanuele Poloni*^1,4, Valentina Medici*¹, Arenn Faye Carlos¹, Annalisa Davin², Arcangelo Ceretti¹, Michela Mangieri¹, Paola Cassini^1,4, Roberta Vaccaro³, Daniele Zaccaria³, Simona Abbondanza³, Matteo Bordoni⁵, Valentina Fantini^2,6, Elena Fogato⁷, Cristina Cereda⁵, Mauro Ceroni⁸, Antonio Guaita^1,2,3

¹Department of Neurology and Neuropathology,Golgi-Cenci Foundation, ²Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic,Golgi-Cenci Foundation, ³Department of Neuropsychology and Social Sciences,Golgi-Cenci Foundation, ⁴Department of Rehabilitation,ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, ⁵Genomic and Post-Genomic Center,IRCCS Mondino Foundation, ⁶Department of Brain and Behavioral Sciences,University of Pavia, ⁷Department of Pathology,ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, ⁸Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation,University of Pavia

Summary

Este protocolo descreve um método para rastrear trajetórias individuais de envelhecimento cerebral através de um programa de doação cerebral e caracterização adequada de cérebros. Doadores cerebrais estão envolvidos em um estudo longitudinal de longo prazo, incluindo avaliações multidimensionais em série. O protocolo contém uma descrição detalhada do processamento cerebral e uma metodologia de diagnóstico precisa.

Abstract

Em uma população em constante envelhecimento, espera-se que a prevalência de distúrbios neurodegenerativos aumente. Compreender os mecanismos da doença é a chave para encontrar medidas preventivas e curativas. A maneira mais eficaz de conseguir isso é através do exame direto do tecido cerebral doente e saudável. Os autores apresentam um protocolo para obter, processar, caracterizar e armazenar tecido cerebral de boa qualidade doado por indivíduos cadastrados em um programa de doação cerebral pré-mortetem. O programa de doação inclui uma abordagem empática presencial das pessoas, uma coleta de informações clínicas, biológicas, sociais e de estilo de vida complementares e avaliações multidimensionais seriais ao longo do tempo para acompanhar trajetórias individuais de envelhecimento normal e declínio cognitivo. Como muitas doenças neurológicas são assimétricas, nosso banco cerebral oferece um protocolo único para cortar espécimes frescos. As seções cerebrais de ambos os hemisférios são alternadamente congeladas (a -80 °C) ou fixadas em formalina; uma fatia fixa em um hemisfério corresponde a uma congelada no outro hemisfério. Com essa abordagem, uma caracterização histológica completa de todo o material congelado pode ser obtida, e estudos de omics podem ser realizados em tecidos histologicamente bem definidos de ambos os hemisférios, oferecendo assim uma avaliação mais completa dos mecanismos neurodegenera da doença. O diagnóstico correto e definitivo dessas doenças só pode ser alcançado combinando a síndrome clínica com a avaliação neuropatológica, que muitas vezes adiciona importantes pistas etiológicas necessárias para interpretar a patogênese. Este método pode ser demorado, caro e limitado, pois abrange apenas uma área geográfica limitada. Independentemente de suas limitações, o alto grau de caracterização que proporciona pode ser gratificante. Nosso objetivo final é estabelecer o primeiro Banco Do Cérebro Italiano, enfatizando o que é importante para estudos epidemiológicos neuropatologicamente verificados.

Introduction

Segundo a OMS, cerca de 50 milhões de pessoas estão atualmente sofrendo de demência, número que deve triplicar até 2050. A Doença de Alzheimer é a principal causa de demência, seguida de doença cerebrovascular e outras doenças neurodegenerativas relacionadas à idade. Em 2017, a OMS desenvolveu o Observatório Global de Demência para aumentar a conscientização sobre a demência e incentivar um plano de ação global contra ela¹. Cada indivíduo tem sua própria trajetória de envelhecimento cerebral, portanto, a busca pela cura pode ser desafiadora devido à complexidade da patogênese das doenças neurodegenerativas. Talvez cada pessoa possua sua própria patogênese escrita no tecido cerebral que requer uma abordagem personalizada. Assim, o estudo do tecido cerebral será a chave para entender os mecanismos da neurodegeneração.

Olhando para trás para a história da neurociência, percebemos que as descobertas mais impressionantes e inovadoras nunca poderiam ter ocorrido sem o exame direto do cérebro humano. Ao longo do tempo, a fonte de tecido cerebral a ser estudado mudou de dissecções brutas, “encontros aleatórios” e, em alguns casos, comércio ilegal, para coleções cerebrais organizadas e bancos cerebrais modernos estratégicos. A consideração de muitos aspectos éticos é um dos principais fatores que diferenciam os bancos cerebrais modernos das coleções cerebrais do passado. Os primeiros verdadeiros bancos cerebrais modernos (BBs) foram instituídos na segunda metade do século^XX. Nicholas Corsellis e Wallace Tourtelotte podem ser considerados pioneiros do banco cerebral moderno. No Reino Unido, Corsellis montou uma coleção com mais de 1000 cérebros bem documentados afetados com vários distúrbios mentais e neurológicos². Além disso, Corsellis ajudou a revelar a necessidade de preservar tecido cerebral fresco no gelo por causa dos testes bioquímicos³. Enquanto isso, nos EUA, Wallace Tourtelotte introduziu programas de doação cerebral antemortem para facilitar a solicitação de potenciais doadores cerebrais e garantir que os cérebros coletados sejam acompanhados de uma história médica e neurológica completa^4,^,⁵. Para uma visão geral histórica das coleções cerebrais e dos BBs modernos, consulte Carlos et al. ⁶.

Então, por que ainda precisamos de cérebros humanos? Doenças cerebrais só podem ser dadas um diagnóstico definitivo após o exame neuropatológico. A neuropatologia desafia o diagnóstico clínico, e é a chave para uma interpretação correta dos sintomas clínicos e para a descoberta das bases histológicas de novas variantes sindómicas. De fato, o diagnóstico pode ser redefinido com base no quadro patológico. No entanto, a taxa de autópsia diminuiu nas últimas décadas devido ao desenvolvimento recente de técnicas inovadoras de neuroimagem. Através da imagem cerebral, as alterações morfológicas, funcionais e metabólicas no cérebro, bem como a extensão do descomposto de proteína, podem ser avaliadas in vivo. No entanto, a neuroimagem in vivo e outros estudos biomarcadores só podem dar uma “estimativa” do quadro patológico, pois são incapazes de detectar alterações celulares e moleculares sutis. Os avanços na imagem molecular e a descoberta de novos biomarcadores, moléculas-alvo e rastreadores⁷ (por exemplo, amiloide, TAU, rastreadores microgliais) tornam o cérebro humano ainda mais indispensável à interpretação de dados obtidos a partir de avaliações clínicas e testes biomarcadores. Além disso, as tecnologias omics (genômica, epigenômica, transcriômica, metabolômica, proteômica, lipidomics, etc.), realizado em tecido cerebral fresco e congelado, abriu novas possibilidades para a compreensão de mecanismos da doença e descoberta de genes de risco, novos marcadores diagnósticos e prognósticos, e potenciais alvos de drogas^8,^,9^,^10,^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,^20,^,⁹²¹^,²²^,²³.

Para esses fins, os BBs modernos arquivam tecidos cerebrais bem caracterizados e de alta qualidade, tornando-os disponíveis para a comunidade científica³^,²⁴. Os cérebros fornecidos pelos BBs devem ser acompanhados por um histórico clínico completo. A atividade de um BB inclui o seguinte: (1) Reconhecimento e recrutamento de indivíduos doentes e saudáveis para programas de doação cerebral; a condição ideal seria realizar um acompanhamento multidisciplinar de doadores ao longo da vida para obter um completo histórico clínico, de estilo de vida e social, e perfis biomarcadores; de fato, a reserva cognitiva e a estrutura cerebral dependem do estilo de vida e dos fatores socioeducativos²⁵^,²⁶, de modo que essas informações enriquecem os dados totais em mãos. (2) Aquisição do cérebro (consistindo de cerebrum, cerebelo e tronco cerebral) e tecidos relacionados (por exemplo, medula espinhal, nervos cranianos e gânglios, etc.) após a morte do doador, observando normas legais e éticas padronizadas. (3) Processamento adequado (dissecção, fixação, congelamento) do cérebro, conforme definido em protocolo operacional padronizado, para obter tecido de alta qualidade e permitir o uso futuro em pesquisas multidisciplinares. (4) Caracterização neuropatológica detalhada proporcionando um diagnóstico definitivo final. (5) Armazenamento e distribuição de material de tecido para a comunidade de pesquisa²⁷^,²⁸.

Todos os BBs armazenam tecidos embutidos congelados e formadolin-fixo-parafina. Cada BB tem seu próprio protocolo. Com exceção de estudos particulares, como o protocolo de corte bihemisférico do Biomedical Research Institute (New Jersey)²⁹ e o estudo do Deuecourt sobre patologia cerebrovascular³⁰, os maiores BBs do mundo simplesmente cortaram o cerebrum, cerebelo e tronco cerebral ao longo da linha média (plano sagital). Uma metade é dissecada fresca e depois congelada para estudos bioquímicos, enquanto a outra é fixada em formalina para avaliação histopatológica. Assim, análises bioquímicas e histopatológicas são conduzidas separadamente em cada hemisfério. A decisão de qual lado é fixo ou congelado (lateralidade), depende do banco singular³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵. Como muitas doenças neurológicas são assimétricas, nosso BB oferece um protocolo único para cortar cérebros frescos: seções adjacentes do tronco cerebral e cada hemisfério são alternadamente fixas e congeladas; uma fatia fixa em um hemisfério corresponde a uma congelada no outro hemisfério. Por meio deste método, o uso do tecido cerebral é otimizado, e uma caracterização histológica completa de todo o material congelado pode ser alcançada com a possibilidade de obter e comparar informações histológicas e bioquímicas de todas as áreas de ambos os hemisférios.

A estrutura do nosso projeto de banco cerebral é a cidade de Abbiategrasso. Abbiategrasso é uma pequena cidade localizada na cidade de Milão, no norte da Itália. Tem uma população de cerca de 32.600 pessoas. Abriga a Fundação Golgi-Cenci (GC). A Fundação GC faz parte de um grande Hospital Geriátrico de Reabilitação (ASP Golgi-Redaelli), e é um instituto focado em pesquisas sobre envelhecimento e cuidados com idosos. Particularmente, foca-se no estudo do envelhecimento mental, dos fatores sociais e comportamentais que o influenciam, e da biologia e patologia subjacentes aos distúrbios neurocognitivos dependentes da idade (DCNT). Em 2009, a Fundação GC lançou um novo estudo longitudinal com 1321 participantes (de 1644 sujeitos elegíveis: taxa de resposta inicial de 80,3%) nascido entre 1935 e 1939 (idade entre 70 e 75 anos), de etnia caucasiana, vivendo na mesma pequena área geográfica. O estudo foi chamado InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; em inglês: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) e está em andamento. O InveCe.Ab está previsto para obter uma coorte com máxima homogeneidade e menor variabilidade para avaliar a incidência, prevalência e histórico natural de demência, juntamente com seus possíveis fatores de risco ou proteção, incluindo variáveis comportamentais, psicossociais, clínicas e biológicas³⁶. As características da coorte são mostradas na Figura 1 e na Tabela 1. Os dados epidemiológicos são consistentes com a tendência de demência na população europeia³⁷^,³⁸ e inveCe.Ab os participantes têm características genéticas e ambientais homogêneas, representando um bom modelo para estudar a trajetória do envelhecimento normal para distúrbios neurocognitivos. De fato, populações homogêneas requerem menos sujeitos para atingir o poder estatístico adequado. A metodologia InveCe.Ab já foi relatada em outros lugares^36, mas é importante sublinhar sua abordagem multidimensional através de verificações periódicas (a cada 2 a 3 anos) utilizando o mesmo conjunto de avaliações, incluindo: amostragem de sangue (painel metabólico, homocisteína e vitaminas, extração de DNA para perfil Apolipoproteína E (APOE) e outros polimorfismos genéticos relacionados à cognição e envelhecimento), medidas antropométricas (peso, altura e cintura), Teste de Caminhada Falante (teste de tarefa dupla), uma entrevista para avaliar o estilo de vida (adesão à dieta mediterrânea, níveis de atividade física e engajamento cognitivo) e fatores sociais (envolvimento social, solidão), uma avaliação neuropsicológica e um exame clínico geral. Comparar tais dados longitudinais com dados neuropatológicos pós-morte seria crucial para a pesquisa. Portanto, nossa equipe e particularmente a Dra. Desde 2014 e durante a segunda continuação, os participantes do InveCe.Ab foram convidados a doar seus cérebros, e assim provocar o nascimento do Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Os principais doadores da ABB são os participantes do InveCe.Ab, mas a ABB está agora aberta a outros doadores voluntários. São pacientes da ASP Golgi-Redaelli, lar de vários pacientes acometidos por diferentes doenças neurológicas ou voluntários adultos que aprendem sobre o Projeto ABB e pertencem à mesma área geográfica (Abbiategrasso e arredores). Todos os doadores passam pelo mesmo protocolo de avaliação.

Os autores propõem um método para rastrear trajetórias individuais de envelhecimento normal e a possível progressão para DCNT, e gerenciar, processar e caracterizar cérebros adquiridos com precisão de tais doadores seguidos longitudinalmente. Além disso, nosso objetivo é atender e engajar indivíduos em avaliações neurológicas periódicas, seminários e atividades educativas sobre o bem-estar do cérebro e aumentar sua conscientização sobre a doação cerebral para fins de pesquisa.

Protocol

Em consonância com o Comitê de Ética em Pesquisa Humana da nossa instituição e o Código de Conduta do BNE, a ABB realiza suas atividades seguindo os padrões éticos39,,40. O procedimento de colheita cerebral foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Pavia no âmbito do estudo InveCe.Ab36. Os procedimentos de estudo estavam de acordo com os princípios descritos na Declaração de Helsinque de 1964 e nas seguintes alterações. O formulário de consentimento é completo e facilmente compreensível. Participar do programa de doação é uma decisão pessoal, e é necessária uma conscientização completa. Caso uma pessoa não seja considerada competente para assinar o termo de consentimento, a autorização do responsável legal ou do parente mais próximo (NOK) é justificada. A Tabela 2 relata critérios de inclusão e exclusão para doação cerebral. A pesquisa foi realizada sob a supervisão da Federazione Alzheimer Italia. 1. Recrutamento para o programa de doação cerebral Convoque os sujeitos que manifestaram interesse em doação de cérebros e seu NOK e/ou responsável legal para apresentar o projeto (o escopo do programa de doação; o processo de remoção do cérebro, conservação, uso e distribuição), o direito de retirada do programa a qualquer momento, a proteção do anonimato e as estratégias de acompanhamento. Discutir a possibilidade de investigações adicionais de biomarcadores e testes genéticos. Observe os desejos do potencial doador ou seu NOK para ser informado sobre os resultados. Explique todos os aspectos econômicos, incluindo a falta de ganho financeiro tanto para a Fundação quanto para o doador (cérebros são doados e distribuídos de forma altruísta). Informe-os que a ABB cobre o custo do transporte do corpo, enquanto a família cobre os do funeral, enterro ou cremação. Em caso de aceitação, obtenha a assinatura do consentimento para participar do programa de doação. Dê ao doador um código numérico individual para garantir o anonimato. Anote o número de identificação daqueles participantes do estudo longitudinal e forneça outro código para que o banco cerebral separe facilmente os dois subgrupos de doadores (participantes ou não participantes do estudo longitudinal; ver Tabela 3). Dê ao doador um cartão de identificação que declare seu status como doador e exiba o número de telefone (disponível 24 horas por dia, 7 dias por semana) para notificar o Banco do Cérebro de sua morte. 2. Avaliação de doadores e acompanhamentos em série NOTA: É possível dar consentimento apenas para alguns, e não todos, dos exames abaixo mencionados. Todas as avaliações clínicas são realizadas pela mesma equipe, incluindo um neurologista, um geriatra com experiência em neurologia e 3 psicólogos. Se novos sintomas se desenvolverem ou o declínio cognitivo progredir, o intervalo de tempo entre os seguimentos pode ser encurtado. Como no caso do estudo InveCe.Ab, obtenha um questionário de estilo de vida-social, incluindo grau de autonomia (ADL, IADL), hábitos pessoais, fatores sociais e de estilo de vida que possam afetar as funções mentais. Coletar história familiar, médica e neurológica com informações relativas a doenças genéticas, infecciosas, tóxicas, metabólicas, autoimunes, cardiovasculares, traumáticas, degenerativas, neoplásicas e neurológicas. Coletar exames clínicos anteriores e listar tratamentos farmacológicos. Realizar uma extensa avaliação neuromotora, incluindo testes para função de nervos cranianos, fundus oculi, campo visual, força muscular e tom, sensibilidades, reflexos tendinosos, reflexos exteroceptivos e primitivos, sinais meningeais, postura, marcha, movimentos, coordenação, funções esfínctericos e qualquer presença de sinais focais ou babinski. Avalie a linguagem, o estado mental e qualquer mudança de comportamento. Realizar uma extensa avaliação neurocognição, incluindo cognição global e uma avaliação neuropsicológica completa de domínios cognitivos específicos: memória verbal e visual, atenção, velocidade psicomotora, linguagem, memória semântica, funções executivas e habilidades visuosespaciais(Tabela 4 para detalhes). Considere a presença de depressão (escala CES-D). Obtenha amostra de sangue que é utilizada tanto para análise de química sanguínea (Tabela 5) quanto isolamento e armazenamento de células mononucleares de DNA, plasma e sangue periférico (PBMC). Determine o genotipagem APOE (rs429358 e rs7412) (um perfil genético mais extenso foi determinado nos participantes do InveCe.Ab; ver Tabela 6). Registre um ECG (alterações cardíacas, fibrilação atrial) e um Electroencefalograma estadual de repouso para análise quantitativa (QEEG). Considere testes biomarcadores opcionais, incluindo fluido cefalorraquidiano (CSF) TAU, fosfo-TAU e β-amilóide, e imagem cerebral (Ressonância Magnética para detectar degeneração in vivo, isquemia ou inflamação; FDG-PET para detectar falha metabólica; PIB-PET para detectar amiloidose cerebral relacionada à fisiopatologia do Alzheimer). Planeje o programa de check-up subsequente do doador cerebral. Configure os intervalos de tempo de acordo com diferentes faixas etárias (até 64 anos: a cada 10 anos, 65 a 74 anos: a cada 3 anos, a partir dos 75 anos: a cada 2 anos). Atribuir um diagnóstico clínico e/ou um diagnóstico neurocognitivo de acordo com o DSM-V. Classificar a apresentação de demência clínica com escore de Classificação de Demência Clínica (CDR). Atualize a CDR no último período antes da morte. Prepare um banco de dados graficamente semelhante ao do papel. Insira todos os dados coletados no banco de dados do Brain Bank. Planeje uma revisão por outro funcionário para verificar se há erros. 3. Hora da morte e remoção cerebral NOTA: A lei italiana estabelece que a asstole deve durar mais de 20 minutos para confirmar a morte. O registro de eletrocardiograma plano (ECG) por pelo menos 20 min (denominado thanatografia) permite que uma autópsia seja realizada no prazo de 24h de óbito (DPR 285/90 art. 8 e Lei nº 578 de 29 de dezembro de 1993). Um tempo pós-morte de 30 h a autópsia é cancelada (ver Tabela 2). A equipe de autópsia é composta por um patologista, um neurologista e/ou um neurobiólogo, uma enfermeira, um técnico de sala anatômica e qualquer aluno estagiário; os dois primeiros membros da equipe também realizam o diagnóstico neuropatológico. Durante o manuseio e dissecção de cadáveres, o uso de roupas apropriadas (casaco, luvas, óculos e rede) é obrigatório. Nesta seção, descrevemos as principais ferramentas e equipamentos normalmente utilizados em nosso laboratório. Os leitores podem escolher os instrumentos a serem usados a seu critério. Para obter uma descrição detalhada dos materiais aqui utilizados, consulte Tabela de Materiais. Certifique-se de que a agência funerária escolhida pela família traga o corpo para as instalações da ABB. Realize a não-tomografia durante a qual a atividade cardíaca deve estar ausente. Se assim for, assine uma certidão de óbito e inicie os procedimentos de autópsia. Transporte o cadáver para a sala de autópsia. Meça a circunferência do crânio ao nível da parte mais larga da cabeça. Meça da nação até a inion para obter o diâmetro anteroposterior (APD), enquanto a distância de um ouvido para o outro produz o diâmetro transversal (TD). Calcule o índice cefálico (IC) utilizando a fórmula: CI = TD/APD x 100. Usando um bisturi afiado, faça uma incisão de couro cabeludo no plano coronal, da ponta do processo mastoide de um lado para o outro, passando sobre o vértice. Corte o cabelo, a pele e o tecido subcutâneo e separe as duas dobras do couro cabeludo cuidadosamente do crânio inferior. Realize a incisão até que a gordura supraorbital amarela se torne visível e reflita o couro cabeludo anteriormente. Puxe a outra parte posteriormente. Usando bisturi e fórceps, pegue uma pequena amostra do músculo temporal de cada lado, coloque um em 4% de formaldeído e congele o outro (ver seção 7). Corte o crânio usando uma serra elétrica após um corte em V no lado frontal. Remova a tampa do crânio e corte as meninges. As amostras de dura são fixadas em 4% de formaldeído e congeladas (ver seção 7). Obtenha cerca de 10 mL de CSF inserindo uma agulha de 20 G 3,5 in. através do caloso corpus para chegar ao terceiro ventrículo. Avalie a aparência, cor e turbidez do CSF e meça o pH. Em seguida, faça 10 alíquotas de cerca de 1 mL cada e armazene-as a -80 °C. Levante o cérebro delicadamente puxando os dois lobos frontais e corte os nervos ópticos infundibulum, as artérias carótidas internas (ICA) e o terceiro, quarto, quinto e sexto nervos cranianos. Corte o tentorium para alcançar a fossa posterior e corte artérias vertebrais e nervos cranianos mais baixos. Insira o bisturi o mais profundo possível através do foramen magnum, para cortar a porção mais caudal da medula. Neste ponto, remova todo o cérebro suavemente. Com o bisturi, fure o osso sobre a caverna de Meckel e obtenha o gânglio gasseriano de ambos os lados. Fixar um gânglio em 4% de formaldeído e congelar o outro (ver seção 7). Frature a sella turcica óssea usando um martelo cirúrgico e um cinzel para remover a glândula pituitária e, em seguida, fixá-la em 4% de formaldeído. Inspecione o crânio e todo o cérebro em busca de alterações macroscópicas e alterações vasculares. Com uma fita métrica, meça o cérebro obtendo os diâmetros transversais e anteroposterior. Recupere com cuidado o círculo de Willis e avalie-o macroscopicamente (Figura 2E) para a presença de variantes anatômicas, lesões ou estenose do vaso. Pegue 1-2 peças de leptomeninges de 2-4 cm2 da convexidade e preserve-as em completa alta glicose Dulbecco’s modificado Mídia Águia (DMEM) média de cultura a 4 °C contendo 20% de soro bovino fetal (FBS), 1% caneta/estreptococo, 1% de glutamina e 1% de aminoácidos não essenciais (conforme publicado anteriormente, com algumas modificações)41. Para obter culturas de fibroblastos, coloque os leptomeninges em uma placa de Petri de 10 cm e lave duas vezes com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS), cada vez descartando o líquido. Usando um bisturi e uma ponta de pipeta, corte as leptomeninges em pequenos pedaços de cerca de 2 ou 3 mm, sementes 3-4 peças em cada poço de uma placa de 6 poços previamente revestida com gelatina a 0,5% e encha cada poço com 2 mL de meio completo suplementado com 1% de anfotérico B (conduza o processamento em um armário de biossegurança para garantir a esterilidade da cultura). Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos uma semana e troque o meio gasto a cada 3-4 dias. Células de trypsinize com trippsina estéril 1x quando o poço está a cerca de 70% de confluência. Coloque os fibroblastos leptomeningeal em um frasco T75 e encha-o com 12 mL de meio completo. Após 5 dias, trippsinize-os e preserve-os em 900 μL de FBS e 100 μL de sulfóxido de dimetil (DMSO). Separe e inspecione cerebrum, cerebelo e tronco cerebral e peso individualmente. Tire a glândula pineal e fixe-a em 4% de formaldeído. Remova lâmpadas olfativas e nervos ópticos, e fixe ou congele um de cada par, independentemente do lado. Mantenha o cerebrum, o cerebelo e o tronco cerebral no gelo a 4 °C por pelo menos 2-4 h até estar pronto para dissecção para minimizar a interrupção do tecido e reduzir a maciez do tecido. Após a colheita, preste atenção e cuidado ao cadáver. Recoloque o osso usando uma cola super adesiva, e costure o couro cabeludo usando uma agulha cirúrgica e suturas não absorvíveis. Mostre respeito e gratidão à pessoa falecida tratando o cadáver gentilmente. Limpe e raspe o rosto, lave e seque o cabelo, porque o cadáver será colocado em um caixão aberto visível aos entes queridos.NOTA: A recomposição do cadáver é feita por um técnico. O protocolo pode ser pausado aqui. 4. Protocolo de dissecção da ABB NOTA: O mesmo patologista e/ou neurologista corta o tronco cerebral, cerebelo e cerebrum sob um capô de fumaça. Um neurobiólogo organiza as fatias após a secção. Um estagiário que não manuseia seções cerebrais documenta todo o procedimento com fotos a serem enviadas para o banco de dados para servir de guia durante as fases subsequentes de processamento de tecidos. Usando uma faca dissecando, corte o tronco cerebral axially e faça o primeiro corte ao nível do cérebro médio rostral, através do collículo superior, para obter duas fatias expondo a substantia nigra (SN). Faça o resto dos cortes para adquirir fatias de 8 mm de tronco cerebral para obter cerca de 10 seções. Tenha cuidado para incluir cortes que passam pelos pons rostrais perto das margens superiores do quarto ventrículo para observar o lócus coeruleus (LC) e através da medula oblongata inferior à estria acústica logo acima do ápice inferior do quarto ventrículo para ter fatias incluindo o núcleo motor dorsal do vagus (DMNV). Nomeie todas as fatias em um sentido rostrocaudal como BS (brainstem) seguido por números árabes para identificar as seções. Após a última seção brainstem, use a designação SC (medula espinhal) seguida pelos números 1-n. Cerca de 2-4 fatias de SC são obtidas dependendo do número de metameres espinhais removidas(Figura 2H-I). Rotule todas as seções a serem fixadas ou congeladas alternadamente e tire uma foto para o arquivo de fotos(Figura 2). Em seguida, conserte e congele todas as fatias conforme descrito abaixo (etapas 4.7 e 4.8). Corte o cerebelo no plano sagital para separar os dois hemisférios cerebelares ao nível dos vermímis. Realizar secção sagital para obter 5 fatias de cada hemisfério (Figura 2F-G). Nomeie todas as fatias de vermis como CBR ou CBL (para cerebelo direito e esquerdo, respectivamente) e use números árabes para identificar as seções. Rotule todas as seções a serem fixadas ou congeladas alternadamente e tire uma foto para o arquivo(Figura 2). Em seguida, conserte e congele todas as fatias conforme descrito abaixo. Separe os dois hemisférios do cerebrum através do caloso corpus(Figura 2A-B) e corte-os singularmente no plano coronal. Faça o primeiro corte em um avião passando entre o quiasma óptico e os corpos mammillary, através do lobo frontal, polo temporal, cingulado anterior, comissure anterior, núcleo de Meynert e gânglios basais. Realizar o segundo corte cerca de 1 cm posteriormente passando pelos corpos mammillary e expondo os gânglios basais, tálamo anterior, subtálamo e amígdala. Continue cortando para dissecar as regiões anterior e posterior para adquirir fatias de 1 cm a fim de obter 15 a 20 seções para cada hemisfério. Coloque as fatias em uma superfície plana. Coloque-os seguindo sua posição original na direção anteroposterior, da frente ao polo occipital, com a porção contínua com a fatia anterior voltada para cima. Comparando as seções de ambos os hemisférios, selecione seções alternativas de cada hemisfério a serem retidas como material fixo ou congelado. Reconheça as principais seções a serem fixadas e processadas para histopatologia, incluindo lobos frontais e temporais, cingulados, gânglios basais, núcleo basalis de Meynert, amígdala, tálamo, hipocampo e córtex entorhinal, giro occipito-temporal, lobos parietal e occipital. Nomeie todas as fatias no sentido anteroposterior como L (esquerda) ou R (direita) seguidos por números árabes e coloque um rótulo indicando se a fatia deve ser fixada ou congelada(Figura 2A-D). Para identificar as seções, tire uma foto para o arquivo de fotos. Em seguida, conserte e congele todas as fatias conforme descrito nas seções 7 e 8. 5. Inspeção cerebral e de vasos e avaliação patológica macroscópica (a olho nu) Realizar um exame macroscópico geral considerando alterações meningeais, atrofia cortical difusa ou localizada, atrofia hipocampal, alargamento ventricular, atrofia cerebelar, atrofia do tronco cerebral, substantia nigra palidez, alterações de matéria branca (especificar tipo e localização). Examine o círculo de Willis considerando aterosclerose e oclusão. Escore de atribuição = 1 na presença de atheroma sem estenose superior a 50%, escore = 2 se pelo menos uma artéria estiver 50% ou mais ocluída, pontuação = 3 se duas ou mais artérias estiverem 50% ou mais ocluídas42. Avaliar a presença ou ausência de patologia em outros vasos intracranianos. Para detectar lesões vasculares parecrímicas, examine hemisférios cerebrais, cerebelo e tronco cerebral. Considere lesões lacunar (diâmetro 10 mm). Se estiver presente, especifique o tamanho em milímetros, número e localização. Considere também a presença ou ausência de hemorragia subaracnóide. 6. Controle da qualidade do tecido NOTA: O escore do fator agonal (AFS) varia entre 0 e 2 e é importante na avaliação da qualidade do tecido. Para determinar a AFS, considere as condições clínicas que ocorrem na hora da morte (particularmente condições determinantes da acidose cerebral) e a duração do estado agonal (morte súbita ou agonia prolongada). Se AFS > 1, o tecido cerebral pode não ser de ótima qualidade43. Considere também o cérebro e o pH CSF; se pH < 6, o tecido cerebral pode não ser de ótima qualidade43,44. Verifique se a morte foi causada por condições que podem danificar o tecido cerebral, incluindo hipóxia, acidose prolongada, ventilação mecânica, falência de vários órgãos, febre alta, trauma craniano grave, ingestão de substâncias neurotóxias, desidratação grave, hipoglicemia grave, estado epiléptico e coma prolongado. Se uma dessas condições estiver presente, atribua 1 ponto. Verifique a duração do estado agonal (rápido se a morte ocorre dentro de 1h, intermediária se a morte ocorre entre 1 e 24 h, lenta se o estado agonal durar mais de 1 dia). Se uma morte intermediária ou lenta acontecer, atribua 1 ponto. Calcule o escore AFS e meça pH CSF por uma agulha de pH eletrodo e pH de tecido por um medidor de pH superficial em uma fatia cerebral de cada lóbulo e em uma seção cerebelar. 7. Congelamento de tecidos Mantenha todos os tecidos congelados no gelo a 4 °C. Então, congelá-los rapidamente. Coloque-os em uma bandeja de alumínio pré-congelada. Cubra com uma placa de alumínio entrelaçada para mantê-los lisos. Coloque-os em nitrogênio líquido a -120 °C por 3 min. Coloque as fatias dentro de um saco plástico rotulado com seu código de identificação correspondente e número de fatia. Divida os sacos plásticos em três caixas criogênicas (para hemisfério direito, hemisfério esquerdo e tronco cerebral) e armazene a -80 °C. 8. Fixação de tecidos Enrole as fatias na gaze uma a uma, e coloque as fatias em solução de formalina tamponada com fosfato de 10%. Após 1 dia, substitua a solução formalina por uma nova solução. Deixe-os por cerca de 5 dias em uma sala fria a 4 °C. Mantenha todas as fatias como um todo e divida apenas as fatias contendo hipocampo e amígdala em duas partes(Figura 3). A parte superior de ambas as fatias conterá o lobo frontal (R10a-L9a na Figura 3); as partes inferiores conterão, respectivamente: (1) amígdala, lobo temporal e gânglios basais (L9b na Figura 3B),e (2) hipocampo e parte do lobo temporal (R10b na Figura 3A). Isso é feito para manter a relação entre as diversas estruturas. Coloque todas as seções no tampão fosfato por pelo menos 2 dias para lavar e remover produtos de ligação cruzada.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. 9. Desidratação, clareira, incorporação de parafinas e preparação de slides Prepare as concentrações crescentes de álcool etílico de 70% a 100%, xileno e dois conjuntos de cera de parafina derretida. Coloque as seções cerebrais no processador automático para desidratação, procedimento de compensação e infiltração de parafina (use dois protocolos diferentes de processamento de tecido para macro (fatias de cerebrum e cerebelo) e microsafina (fatias de tronco cerebral e outras pequenas amostras); Tabela 7). Incorpore o tecido em cera de parafina em um molde de metal ou plástico. Selecione as seções a fatia para avaliar todas as regiões de interesse aplicando o índice de Montine para caracterização neuropatológica45 (Tabela 8). Em seguida, corte as seções selecionadas. Use um microtome de trenó para macrosecções e um microtome rotativo para pequenas seções. Corte 5 fatias de μm para a coloração de Haematoxylin e Eosin (H&E) e fatias de 8 μm para as outras manchas e imunohistoquímica. Coloque as fatias em três tipos diferentes de slides histológicos: 8,5 cm x 11 cm para fatias maiores, 5 cm x 7,5 cm para fatias médias e o clássico 2,5 cm x 7,5 cm para as menores.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. 10. Desparafinação, coloração histológica e imunohistoquímica (IHC) Realize a desparaffinização para permitir a reação com soluções de corante aquoso. Executá-lo usando xileno e diminuição da concentração de álcool (5 minutos para cada passo). Reidratar por 5 min com água destilada. Utilize as seguintes manchas histológicas para avaliar anormalidades arquitetônicas e estruturais de tecidos, e morfologia celular: H&E (para lesões microscópicas vasculares e inflamação), Cresyl Violet (NISSL; para perda neuronal), Luxol Fast Blue (LFB; para desmielinização), Gallyas (para placas neuríticas e fios neurográficos). Use a imunohistoquímica (IHC) para destacar a presença de estruturas de alvo específicas. Anti-NeuN e anti-GFAP são usados para identificar compartimentos neuronais e gliais; 4G8, AT8, α-SYN e TDP-43 são utilizados para identificar proteínas que agregam em doenças neurodegenerativas(Tabela de Materiais). Seções de deswaxed pré-tratamento com 3% H2O2 por 10 min e enxágue em PBS. Realizar tratamento de recuperação com tampão citrato 0,01 M pH 6 (micro-ondas serialmente por 2, 1 e 2 min) para antígenos 4G8, α-SYN, TDP-43 e NeuN; usar ácido fórmico de 70% para 4G8 e α-SYN. Pré-insususinar por 30 min em 5% de soro normal de cabra. Incubar durante a noite a 4 °C com o anticorpo primário. No dia seguinte, enxágue as seções em PBS antes da incubação com o anticorpo secundário (Polímero rotulado De Sistema Envision+) a uma diluição de 1:2 em PBS por 1h à temperatura ambiente. Lave várias vezes em PBS e incuba em sistema de cromogênio com diaminobenzidina (Sistema Líquido de Cromosgênico DAB+Substrato) olhando para o desenvolvimento de reação sob o microscópio (ampliação 4-10x). Finalmente lave as seções em PBS. Contra-retiver as seções em hematoxilina, desidratar e cobrir com montagem DPX.NOTA: A Tabela 8 resume o protocolo padrão. Execute a coloração de H&E em todas as seções, enquanto manchas e reações especiais/específicas são usadas em seções selecionadas. Os casos selecionados requerem áreas ou reações adicionais. Tabela de Materiais mostra os detalhes dos anticorpos usados para IHC. 11. Caracterização neuropatológica básica NOTA: Alterações inespecíficas do tecido cerebral, patologia vascular, patologia da Doença de Alzheimer (DA), TAUopatias não AD, sinucleinopatias, proteína de ligação de DNA tar (TDP-43) patologia e lesões hipocampais são estudadas. Um microscópio óptico conectado a uma câmera é usado para detectar lesões microscópicas parenchímicas. A avaliação histológica é realizada pela mesma equipe de pessoal treinado em neuropatologia, incluindo um professor de neurologia, um neurologista e um patologista. Baseia-se na abordagem45 (Tabela 8)modificada de Montine, incluindo também: (1) TAUopatias não-AD heterogêneas que constituem a marca patológica da Degeneração do Lobo Fronto-Temporal (FTLD) relacionada aos depósitos tau: doença de Pick, Afasia Progressiva Progressiva não fluente (TAU-nfPPA), Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP)46,47 e Degeneração Cortico-Basal (CBD)48. Além disso, as TAUopatias não-AD incluem condições relacionadas ao envelhecimento e sem significância clínica definida, como TAUopatia Relacionada à Idade Primária (PART)49, Tau Astro-Gliopathy (ARTAG)50, doença do grão arlífico48. (2) Synucleinopatia tipo Lewy (LTS) que está relacionada à Doença de Parkinson (DP) e Demência de Corpos De Lewy (LBD). Para procurar o LTS, aplique os seguintes passos hierárquicos: em primeiro lugar, bulbo olfativo, tronco cerebral, amígdala/córtex temporal; se as áreas anteriores forem positivas, adicione estruturas límbicas (formação hipocampal, córtex entorhinal, cingulado anterior), giro frontal médio, lobule parietal inferior e córtex occipital45. Se as características clínicas da LBD cortical estiverem presentes (ou seja, flutuações e/ou alucinações), considere estruturas límbicas e isocócticas para o primeiro passo. (3) Depósitos TDP-43, a marca patológica do FTLD relacionada aos depósitos TDP-43: variante comportamental da Demência Fronto-Temporal (bvFTD), Demência Semântica (SD ou svFTD), TDP-nfPPA e Doença do Neurônio Motor FTD (FTD-MND). O IHC para TDP-43 é realizado nas seguintes seções: amígdala, hipocampo, córtex entorhinal e giro frontal médio; em casos com suspeita de FTLD clínico, considere examinar outras seções51. Avalie alterações inespecíficas no tecido cerebral em seções selecionadas usando H&E, NISSL, LFB e IHC para GFAP e NeuN. Considere a rarefação neuronal, neurônios em balões, esponiência, gliose, perda de mielina, presença ou ausência de infiltrados inflamatórios ou tumorais. Especifique a localização prevalente dessas alterações. Para detectar lesões vasculares microscópicas,examine os slides de H&E e LFB, incluindo pelo menos duas macrossfações hemisféricas (a primeira que passa pelos corpos mammillários (corte de Charcot) com lobos frontais e temporais, gânglios basais, tálamo anterior, amígdala, e o segundo passando pelo lobo occipital), a seção “geniculado” da formação hipocampal, uma seção cerebelar, e todas as três seções principais do tronco cerebral (através da substantia nigra, locus coeruleus e DMNV). Detecte doenças de pequenos vasos, incluindo arteriolosclerose, lipohialinose, dilatação do espaço perivascular, perda de matéria branca, leptomeningeal e/ou angiopatia cerebral parênquia e/ou capilar. Especificar classificação (0-3) e localização prevalente42,52. Considere a presença ou ausência de vazamento de hemosidrina, microeboldos e microinfartos. Avaliar a contribuição dos danos vasculares ao comprometimento cognitivo utilizando o esquema hierárquico de Deuecourt (alterações na parede do vaso – doença de pequenos vasos – infartos macroscópicos). Para esta avaliação considere uma seção de lobo frontal e temporal, gânglio basal e hipocampo (pontuação 0-20)30. Além disso, estimar a probabilidade de que a doença vascular cerebral tenha contribuído para o comprometimento cognitivo utilizando escore de VCING (baixo intermediário-alto), obtido por considerar infartos macroscópicos hemisféricos e doença de pequenos vasos do lobo occipital, incluindo arteriolosclerose moderada a grave e angiopatia amiloide53. Avalie a patologia de AD usando IHC (4G8) para propagação amiloide. Definir as etapas de Thal (1-5)54, pontuação amiloide agregada (0-3)45e morfologia por local (difusa, focal, cored). Avalie a patologia AD Tau usando IHC (AT8) e descreva a morfologia prevalente por local (emaranhados neurofibrilares, fios neuropilos, placas neuríticas). Definir o estágio de Braak (I–VI +; sinal positivo indica a presença de áreas adicionais de patologia tau hiperfosforilada não seguindo a hierarquia de Braak)55 e pontuação agregada (0-3)45. Avalie as placas neuríticas utilizando manchas de Gallyas e pontuação CERAD (0-3)56. Em seguida, defina a probabilidade das características neuropatológicas correspondentes a uma síndrome clínica da DAutilizando a pontuação A myloid-B raak-C ERAD (pontuação ABC 0-3): nenhum-baixo-intermediário-altoB45.C Use o AT8 IHC para notar a presença ou ausência de patologia tau não-AD especificando localização prevalente e imagem morfológica peculiar. Considere inclusões neuronais como emaranhados em forma de chama ou globose, inclusões esféricas-globulares (ou seja, corpos de Pick)57, fios neuropilos, neurites distróficos, grãos arlífilos; e inclusões gliais como astrócitos tufos, astrócitos espinhosos, placas astróciticas, corpos enrolados, inclusões globulares58,59. Use α-syn IHC para detectar LTS (corpos de Lewy, corpos pálidos e neurites lewy) nas áreas da nota acima. Em caso de positividade, aplique a classificação de McKeith (0-4) para avaliar a gravidade das lesões60; em seguida, use os estágios de Beach (I-IV) para distribuição topográfica (bulbo olfativa, cérebro predominante, predominante límbico, neocortical)61. Compare os estágios de Beach e Braak para definir a relação entre LBD e patologia da AD60,61,62. Considere a presença ou ausência de Inclusões Citoplasmáticas Gliais (GCI; sinucleinopatia glial não do tipo Lewy) que são a marca patológica da Atrofia do Sistema Múltiplo (MSA) e especifique sua localização prevalente63. Use o TDP-43 IHC para detectar depósitos TDP-43 nas áreas da nota acima. Identificar a morfologia prevalente por local: Inclusões Citoplasmáticas Neuronais (NCIs), Inclusões de Neurites Distróficas (DNs), Inclusões Nucleares (NIIs). Definir o padrão: A (NCIs e DNs predominantes: bvFTD e nfPPA); B (NCIs predominantes: FTD-MND); C (DNs longos predominantes: svPPA e bvFTD)51,64. Use o esquema de Nelson para definir a presença de TDP-43 nos casos AD65,66. Avalie o hipocampo a partir do setor subiculum e Sommer (CA1). Utilizar a pontuação do Rauramaa (0-4): 1-2 para microinfartos e macroinfartos, respectivamente; 3-4 correspondente à perda neuronal moderada e grave, respectivamente, e atrofia hipocampal (esclerose hipocampal: HS). Apontar a presença ou ausência de depósitos de proteína patológica (em ordem decrescente de frequência: pTAU, TDP-43, α-syn)67. Defina o diagnóstico neuropatológico e insira todos os dados patológicos no banco de dados.NOTA: As salas em que o material biológico e os dados sensíveis dos doadores são armazenados estão sempre bloqueados e apenas o pessoal autorizado pode entrar, a fim de garantir segurança e privacidade. O material biológico congelado é armazenado em freezers trancados a -80 °C, enquanto tecidos embutidos em parafina fixas por formalina são armazenados em armários trancados à temperatura ambiente. Dois freezers de motor são usados e um freezer de backup também está presente. Além disso, para garantir que os freezers estejam sempre funcionando, eles são fornecidos com um sistema de monitoramento 24 horas por dia, 7 dias por semana, que dispara um alarme. Um gerador de emergência também está presente, em caso de falha de energia. Os participantes são anonimizados com um código numérico para garantir sua privacidade; não é possível que pessoas não autorizadas voltem à identidade dos doadores e seus dados sensíveis. Todas as informações são coletadas em um banco de dados protegido por senha; da mesma forma, uma cópia impressa desses dados é mantida em arquivos bloqueados.

Representative Results

Doadores cerebrais e dados de colheita cerebralEm 2014, o recrutamento de doadores começou durante o segundo acompanhamento do InveCe.Ab, envolvendo 1010 dos 1061 sujeitos elegíveis (taxa de resposta: 93%; Figura 1). Em relação ao estudo longitudinal InveCe.Ab, 290 dos 1010 participantes (28,7%) concordaram em se cadastrar como doadores (160 já cadastrados e 130 que manifestaram intenção de se cadastrar). O nível educacional é maior em doadores do que em não doadores (66% dos nossos doadores têm nível médio-médio de escolaridade: 8 ou mais anos de escola), indicando a importância da cultura e da educação. Muitos indivíduos “saudáveis” também demonstraram interesse no programa de doação de cérebros. A maioria dos nossos “controles” confessa que eles podem simpatizar com os doentes e seus parentes, e querem contribuir de alguma forma para pesquisas que levem a uma melhor compreensão das doenças neurológicas. Pessoas altruístas que regularmente se envolvem em programas de doação de sangue ou medula durante a vida estão mais abertas à ideia de doação cerebral, assim como pessoas que já concordaram em doar órgãos após a morte. Eles estão cientes do fato de que, embora não houvesse um beneficiário vivo, sua doação seria de grande importância para a pesquisa. Outro fator que contribui para a doação de cérebros é a preferência a ser cremada. Atualmente, a população de doadores da ABB conta com um total de 427 indivíduos (290 participantes do InveCe.Ab + 137 voluntários ou pacientes do Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli), dos quais 75% têm 70 anos ou mais. Há uma clara predominância das fêmeas (64%) e idosos mentalmente intactos (cerca de 85%). Até agora, 27 cérebros foram colhidos de 40 doadores falecidos (67% de taxa de autópsia); 13 indivíduos não foram autopsiados por várias razões, incluindo falha no relato da morte à ABB, lesões graves que levaram à destruição cerebral, doenças infecciosas perigosas e 1 caso de DCC; 4 sujeitos revogaram seu consentimento. Até agora, 24 dos 27 cérebros colhidos receberam uma caracterização neuropatológica completa com um diagnóstico clínico-patológico definitivo, enquanto os 3 cérebros restantes ainda estão em análise(Tabela 3). Dados adicionais de coleta cerebral da ABB incluem: idade média na morte (81 anos); intervalo pós-morte médio (10,37 h); pH média CSF (6,64); pH de tecido médio (6,07); peso cerebral médio (1012,86 gr); AFS foi 1 em 90% dos sujeitos falecidos. Biomarcadores neurofisiológicos (QEEG)QEEG é parte da abordagem multidimensional. É um método simples, não invasivo e barato, com um potencial provável para detectar a conversão de transtorno neurocognitivo leve (NCD leve ou MCI) para o transtorno neurocognitivo principal (NCD maior ou demência). Durante toda a nossa abordagem multidimensional, um simples exame QEEG é realizado e seu possível papel como biomarcador para demência é testado. Nossos dados de uma série preliminar de 36 doadores cerebrais (18 idosos normais (NOLD), 11 NCD leve e 7 maior-NCD; 9 dos quais com diagnóstico neuropatológico definitivo) indicam que a porcentagem média do ritmo alfa foi significativamente menor em NCD maior em comparação com NCD leve (p: 0.002) e NOLD (p: 0,033). Por outro lado, as frequências de EEG mais lentas (theta/delta) foram significativamente maiores em NCD maior do que em NOLD/mild-NCD (veja os casos de exemplo na Figura 4). Em nossa série, a distribuição do ritmo EEG pode diferenciar os sujeitos noLD/leve-NCD de pacientes com NDC principal, independentemente do diagnóstico etiológico, sugerindo que os ritmos cerebrais são influenciados pela carga de lesões degenerativas, independentemente do tipo de lesão. De fato, 7 em 9 cérebros examinados mostram demência devido a patologias mistas. A especificidade sobre a natureza da patologia parece ser baixa e os ritmos elétricos cerebrais parecem ser influenciados mais pela carga e topografia das lesões do que por sua natureza molecular (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lisboa, dados inéditos). Casos emblemáticosO protocolo ABB pode ser útil e necessário em alguns casos e condições. Um exemplo é a presença de uma patologiaassimétrica (Figura 5). Nosso protocolo é muito adequado para a identificação e caracterização adequada desse tipo de patologia. Até agora, examinamos 4 cérebros com envolvimento assimétrico, alguns dos quais são mostrados na Figura 5. A atrofia macroscopicamente, do lado direito (Figura 5A)está presente em um caso com dilatação ventricular grave na seção coronal direita(Figura 5C) em comparação com o lado esquerdo(Figura 5B). Outra caixa apresenta infarto do hemisfério direito(Figura 5D) e outra mostra uma atrofia clara do corpo mammillary direito(Figura 5E). No nível microscópico, um caso de FTLD mostra uma positividade TDP-43 assimétrica que é mais intensa no lado frontal direito em comparação com a esquerda(Figura 5F,G). As macrosecções(Figura 6A,C) são usadas para ter uma visão geral. A coloração LFB ajuda a identificar a perda demielina (Figura 6D) e o IHC tanto para 4G8 quanto para AT8 (Figura 6B) permite avaliar a distribuição da imunoreatividade nos hemisférios a olho nu. Na série ABB, cérebros de indivíduos relacionados estão disponíveis para serem comparados. Na Figura 7,imagens microscópicas de seções do cérebro de gêmeos homozigos são colocadas lado a lado para uma comparação mais fácil (gêmeo 1 (BB137): Figura 7A,C,E,G,I,K versus gêmeo 2 (BB138: Figura 7B, D,F,H,J,L). Como em um estudo anterior semelhante68, ambos os gêmeos foram comparados por avaliações clínicas e neuropatológicas. Os gêmeos relataram o mesmo diagnóstico de DCNT maior devido a múltiplas etiologias, mas morreram com dois anos de diferença, aos 83 anos (demência-início aos 72 anos) e 85 (demência-início aos 76 anos), respectivamente. Seus cérebros têm um quadro neuropatológico muito semelhante, com alta patologia da DA associada à angiopatia amiloide. A imunoreatividade 4G8 é difundida em todo o córtex (Figura 7A,B) e gânglios basais(Figura 7C,D) com placas difusas, densas e coradas. Também é claramente detectado em vasos parenchímicos e leptomeningeal do córtex e do cerebelo(Figura 7A,B,G-J). Em maior ampliação, o capCAA é claramente evidente(Figura 7G,H). Placas imunopositivas AT8, emaranhados e fios são difusos nos cortices parietal de ambos os cérebros(Figura 7E,F,L). Em relação à carga patológica amiloide e NFT, o gêmeo 1 é considerado um Thal estágio 3 (montine A2) e um Braak estágio 5 (montine B3), enquanto o gêmeo 2 é considerado um Thal estágio 5 (montine A3) e um Braak estágio 6 (montine B3). Eles tiveram os mesmos anos de educação e estilo de vida semelhante; no entanto, um (BB137) foi casado e ficou viúvo logo depois, enquanto o outro estava solteiro (BB138). Apresentaram diferentes graus de variabilidade clínico-patológica com o mesmo início e mesmo curso da doença, mas em períodos de tempo diferentes. Isso confirma o fato de que, embora o componente genético tenha um papel fundamental no desenvolvimento da doença, o componente epigenético e ambiental são fundamentais na determinação de manifestações ligeiramente diferentes. Em alguns casos, o quadro clínico não corresponde às características neuropatológicas. Na Figura 8,dois casos diferentes foram clinicamente definidos como casos de DA; análises neuropatológicas mostram, além de uma patologia intermediária da AD, uma positividade difusa para α-syn. No primeiro caso, uma foto grave de LTS (Praia IV) mostra corpos de Lewy encontrados de forma homogênea em todo o gyrus cingoli(Figura 8A) e em SN como inclusões citoplasmáticas cercadas por neuromelanina(Figura 8B,C). No segundo caso, os corpos de Lewy associados aos neurites de Lewy são distribuídos difusamente na amígdala (Figura 8D,E) e no núcleo de Meynert(Figura 8F,G) sugerindo um diagnóstico límbico de LTS. De fato, a topografia das lesões em vez de sua natureza molecular produz as manifestações clínicas. Figura 1: Gráfico de fluxo do estudo Inve.Ce.Ab. Na linha de base, a prevalência global de demência foi de 3%. Durante os seguimentos, as prevalências foram: 4,4%(1º)69, 7,1% (2º), 10,9%nd(3º).rd A taxa de incidência de oito anos foi de 15 p/1000/ano (IC95%: 13-18 p/1000/ano). O recrutamento de doadores começou em 2014 (durante o segundo acompanhamento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Protocolo de dissecação de cerebrum (A), cerebelo (F) e brainstem (H). Círculo de Willis e hemisférios únicos são mostrados em (E) e (B). Os cortes coronais da direita (C) e do lado esquerdo(D)são numerados e, alternativamente, fixados (“F”) e congelados (“C”). Seções de cerebelo sagitar(G)e seções axiais do tronco cerebral(I) são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: São mostradas fatias coronais de lobo dianteiro-temporal fixo (A) e esquerdo (B).Hipocampo e lobo temporal (A, R10b) são separados do lobo frontal (A, R10a) na fatia direita. Na fatia oposta, a amígdala e a gânglio basal (B, L9b) são divididas do lobo frontal (B, L9a). Barra de escala: 1,7 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Distribuição relativa de energia espectral em sujeitos NOLD e NCD principal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Imagens representativas de patologias assimétricas. (A) Primeiro caso: cérebro com atrofia direita. As fatias coronais(B) e(C) mostram dilatação ventricular do lado direito particularmente evidente nas seções 10-12 (C, setas). Nas seções (B) e (C), “F” significa fixo e “C” para congelado (em italiano: congelato). (D) Segundo caso: infarto severo do hemisfério direito. (E) Terceiro caso: atrofia do corpo mammillary direito (seta). (F, G) Quarto caso: imagens microscópicas mostram uma imunoreatividade TDP-43 mais intensa no córtex frontal direito (G) em comparação com a esquerda (F) em um caso de demência frontotemporal. Barras de escala: 183 μm (F, G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Macrosections. (A, C) Fatias coronais de lobo fronto-temporal fixo (A) e lobo parietal fresco (C). (B) Seção fronto-temporal histológica imunolabelada com anticorpo AT8. A imunoreatividade é claramente distribuída por todo o córtex, mas mais intensa no lobo temporal. (D) Seção parietal histológica manchada com LFB. A seta indica uma área de desmielinização da matéria branca. Barra de escala: 1,55 cm (B, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Gêmeos. Comparação entre cérebros de dois gêmeos homozigosos: BB137 (A, C, E, G, I, K) e BB138 (B, D, F, H, J, L). As fotos neuropatológicas são muito semelhantes. (A) e (B) mostram positividade difusa 4G8 no lobo occipital com placa amiloide, leptomeningeal (setas) e vasos parenchymal (pontas de flecha). A angiopatia amiloide capilar (asteriscos) é bem reconhecida em ampliações mais altas(G) e(H). O 4G8 é distribuído difusamente por toda a gânglio basal (C, D) e em torno de vasos leptomeningeais de cerebelo(I, J: setas). Imunoreatividade AT8 identifica emaranhados, fios e placas (setas) no córtex parietal(E, F). A coloração de Gallyas(K)revela placas neuríticas como o anticorpo AT8(L) faz. Barras de escala: 470 μm (A-F; I-J); 90 μm (G-H; K-L). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Diagnóstico clínico versus neuropatológico. Nesse número, são notificados dois casos diferentes em que o diagnóstico neuropatológico difere do diagnóstico clínico. A imunoreatividade para α-syn é um resultado inesperado. (A–C) Primeiro caso: Gyrus cingoli (A) mostra distribuição homogênea de corpos de Lewy em SN (setas B). Em um neurônio de SN, um corpo duplo de Lewy cercado por neuromelanina é mostrado (C). (D–G) Segundo caso: Uma positividade difusa para α-syn é detectável no núcleo amígdala (D, E) e Meynert (F, G). Corpos celulares e neurites lewy (asterisco) estão bem marcados. Barras de escala: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: Modelo de contrato de transferência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. N % Gênero Machos 607 45.9 Fêmeas 714 54.1 Coorte de nascimento 1935 236 17.8 1936 219 16.6 1937 264 20.0 1938 305 23.1 1939 297 22.5 Estado civil Casado 872 66.1 Coabitam 13 1.0 Separados/Divorciados 29 2.2 Viúva 325 24.6 Único 80 6.1 Ocupação da vida primária Trabalhadores de colarinho azul 666 50.6 Trabalhadores de colarinho branco 459 34.9 Dona 191 14.5 Anos de educação ≤5 anos 754 57.2 >5 anos 565 42.8 Tabela 1: Características sociodemográficas dos participantes do estudo InveCe.Ab. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Todos os indivíduos com 18 anos ou mais Pessoas que recusam descaradamente a doação Pessoas que vivem dentro do território de Abbiategrasso Pessoas que vivem fora da região da Lombardia Voluntários que dão consentimento por conta própria Discrepâncias entre o potencial doador e os noks desejos em relação à doação cerebral Sujeitos incapazes de decidir com a permissão da NOK Situações que destroem muito a consistência do cérebro Morte por uma causa natural Curso clínico de <2 anos a menos que a possibilidade de uma doença de prímion tenha sido excluída Morte causada por homicídio ou suicídio, com a necessidade de um relatório do legista Intervalo pós mortem >30 horas Tabela 2: Critérios para doação cerebral. N° sexo CÓDIGO BB Código InveCe Idade edu (yrs) Diagnóstico clínico Cdr Afs PM (hrs) tecido pH bebida alcoólica pH diagnóstico neuropatológico 1 F BB 37 87 5 Major-NCD devido a AD (BPSD) 5 2 29 Nd Nd Alta patologia de AD, SVD moderado, TDP43+, ctx LTS, HS 2 F BB 105 94 5 Major-NCD devido ao AD 5 1 5 5.72 6.78 Alta patologia de AD, SVD leve, HS 3 F BB 137 83 3 Major-NCD devido a múltiplas etiologias (AD-VaD) 5 1 16 Nd Nd Alta patologia da AD, SVD moderada, infarto occipital, CAA-capCAA 4 M BB 181 71 13 Major-NCD devido a AD (BPSD) 5 2 3 Nd Nd LTS Grave (Praia IV), patologia intermediária de AD, leveSVD, mCAA 5 M BB 115 Eu 636 78 18 Major-NCD devido ao AD 5 1 6 Nd Nd AD intermediário, SVD moderado, inflamação, ILBD (Beach IIa), HS 6 F BB 23 Eu 65 79 3 NCD maior devido a doença vascular 5 1 14 Nd Nd CAA grave e difundido, patologia intermediária de AD 7 M BB 102 Eu 412 79 8 NCD maior devido a doença vascular 3 1 8 Nd Nd Demência Vascular, ILBD 8 M BB 224 Eu tenho 16 anos. 80 3 Major-NCD devido a múltiplas etiologias 5 1 11 Nd 5.99 SVD moderado, patologia de baixo AD, ILBD (Beach IIa), HS 9 F BB 47 78 5 Major-NCD para várias etiologias (LBD-VaD BPSD) 5 0 8 Nd Nd Alta patologia de AD, patologia BG TAU, ARTAG, SVD leve, HS 10 F BB 153 Eu 965 79 5 NCD leve (morte por câncer de cólon com metástase generalizada) 0.5 1 8 Nd 6.73 Baixa patologia de AD, BG-SVD moderada 11 M BB 118 I 1211 79 13 NOLD (morte por câncer de fígado) 0 2 3 Nd 6.51 SVD moderado 12 M BB 236 Eu 521 80 3 Major-NCD devido a AD (BPSD) 4 1 15 Nd 6.15 Alta patologia de AD, BG-SVD grave (vários microbleeds), HS 13 F BB 138 85 3 Major-NCD devido a múltiplas etiologias (AD-VaD BPSD) 4 0 15 Nd 6.75 Alta patologia da AD, SVD moderada, CAA, TDP43 límbico 14 M BB 109 Eu 876 79 8 NOLD (morte por tumor cerebral – GBL) 0 1 16 Nd 6.4 Baixa patologia de AD, ILBD (Beach IIa), SVD leve 15 F BB 271 84 8 Major-NCD devido a AD (BPSD) 4 1 2 Nd 6.7 AD intermediário, LTS límbico, BG-SVD moderado, mCAA, TDP 16 F BB 71 Eu 1080 79 8 NOLD (morte por insuficiência cardíaca) 0 0 6 Nd 6.26 BG-SVD moderado, ILBD, amy TDP, baixo AD 17 F BB 189 Eu 858 80 5 Major-NCD devido a AD (BPSD) 3 0 20 Nd 6.42 AD intermediário, CAA-capCAA, TDP43, BG-SVD moderado, HS 18 F BB 278 Eu 924 80 5 Major-NCD devido ao LBD (BPSD) 3 1 5 6.02 7.05 AD intermediário, LTS límbico (Praia IV), TDP límbico, HS 19 F BB 247 104 8 Major-NCD devido a múltiplas etiologias (provavelmente patologia mista) 3 0 6 6.48 7.22 Patologia TAU (PART-ARTAG), HS 20 M BB 85 Eu tenho 19 anos. 83 10 Major-NCD devido ao LBD (BPSD) 3 1 9 6.26 7.3 LTS límbico grave, AD intermediário, SVD Moderado, CAA-capCAA grave, HS 21 F BB 14 Eu 222 82 8 Major-NCD devido a múltiplas etiologias (AD-VaD) 2 1 11 5.59 6.4 Patologia intermediária de AD, SVD moderada 22 F BB 282 76 8 NCD Frontal temporário Maior (nfPPA BPSD) 3 1 10 6.07 6.39 TDP (tipo A), ILBD, SVD moderado, baixo AD, HS 23 F BB 154 Eu 1079 80 5 NOLD (morte por câncer com metástase generalizada) 0 1 5 6.49 6.9 SVD moderado, CAA, baixo AD, encefalite límbica 24 F BB 290 65 13 NCD frontotemporal maior (bvFTD BPSD) 5 1 12 5.73 6.42 TDP (tipo A) 25 F BB 210 89 8 Major-NCD devido a AD (BPSD) 5 1 15 5.94 6.4 em andamento 26 M BB 293 75 18 NCD Frontal temporário Maior (bvFTD BPSD) 5 1 8 6.14 6.83 em andamento 27 F BB 99 Eu 1370 79 9 NOLD (morte por choque séptico) 0 2 14 6.3 7.12 em andamento M/F significa significa significa significa significa significa significa 0.5 81 7.7 3.2 1.0 10.4 6.1 6.6 Tabela 3: Diagnóstico clínico/neuropatológico da série ABB. BB: Brain Bank; edu (yrs): anos educativos; CDR: Classificação de Demência Clínica (0 = sem demência; 0,5 = comprometimento cognitivo leve; 1 = demência leve; 2 = demência moderada; 3 = demência grave; 4 = demência muito grave; 5 = demência terminal); AFS: Pontuação do fator agonal; PM (hrs): Horas post mortem; nd: não feito; M/F: Machos/Fêmeas; BPSD: Sintomas Comportamentais e Psicológicos da Demência; Vad: Demência vascular; NOLD: Idosos normais; GBL: Glioblastoma; nfPPA: afasia progressiva primária não fluente; bvFTD: variante comportamental da Demência Frontotemporal; SVD: Doença de pequenos vasos; LTS: Synucleinopatia tipo Lewy; HS: Esclerose hipocampal; CAA: Angiopatia Amiloide Cerebral; capCAA: CAA capilar; mCAA: CAA meningeal; ILBD: Doença corporal de Lewy Incidental; BG: Basal Ganglia; ARTAG: Astro-gliopatia TAU relacionada à idade; PARTE: TAUopatia relacionada à Idade Primária; amy: amigdala. Domínio Nome do teste Depressão Centro de Estudos Epidemiológicos Escala de Depressão (CES-D) [2] Cognição global Mini-Exame de Estado Mental (MMSE) [1] Memória verbal e visual Teste de lembrar seletiva gratuito e cued [3] Teste de Corsi [4] Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Recall [5] Atenção/ velocidade psicomotora Trilha fazendo A [6] Matrizes De atenção [4] Memória semântica de linguagem Fluência verbal semântica (cores, animais, frutas, cidades) [4] Funções executivas Trilha fazendo B [6] Matrizes Coloridas de Raven [7] Habilidades visuosespaciais Teste de desenho do relógio (CDT) [8] Cópia do Complexo de Rey-Osterrieth (ROCF) [5] Tabela 4: Avaliação neuropsicológica para doadores cerebrais. Metabolitos Contagem de sangue completa HDL de colesterol e LDL Triglicerídeos Glicose Hemoglobina glicocada (HbA1c) Homocisteína Cobalamina (Vitamina B12) Folato Albumina Uréia Creatinina Transaminases (ALT e AST) Gamma Glutamyl transferase Hormônio estimulante da tireoide (TSH) Vitamina D (25-hidroxi-vitamina D) Proteína C-Reativa (CRP) Eletrólitos Tabela 5: Painel metabólico para doadores cerebrais. NOME DO GENE dbSNP Apolipoproteína E (APOE) rs429358 rs7412 Catalase (CAT) rs1001179 Superóxido dismutase 2 (SOD2) rs4880 Angiotensinogênio (AGT) rs699 Sirtuin 2 (SIRT2) rs10410544 Translocase da membrana mitocondrial externa 40 (TOMM40) rs2075650 Integrador de ponte 1 (BIN1) rs7561528 Catechol-O-metiltransferase (COMT) rs4680 Reductase de metilenotetrahidrotalato (MTHFR) rs1801133 rs1801131 Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) rs6265 família transportadora solute 6, membro 4 (SLC6A4 ou 5HTT) Região polimórfica ligada ao gene do transportador de hidroxitrico (5-HTTLPR) rs25531 Tabela 6: SNPs analisados para doadores cerebrais InveCe.Ab. Processo Solução Duração AMOSTRAS DE MACRO MICRO AMOSTRAS Fixação FORMALINA 10% TAMPONADA 8 dias a 4 °C 8 dias a 4 °C Lavar TAMPÃO FOSFATO 2-15 dias em temperatura ambiente 2-15 dias em temperatura ambiente Lavar H2O WASH 2-3 h, água da torneira 2-3 h, água da torneira Desidratação ÁLCOOL ETÍLICO 70% 24 h 8 h Desidratação ÁLCOOL ETTIL 80% 24 h 4 h Desidratação ÁLCOOL ETÍLICO 90% 60 h (geralmente no fim de semana) 4 h Desidratação ÁLCOOL ETTIL 95% 12 h 4 h Desidratação ÁLCOOL ETTIL 95% 12 h 4 h Desidratação ÁLCOOL ETTIL 100% 6 h 4 h Desidratação ÁLCOOL ETTIL 100% 6 h 4 h Limpar XILENO I 12 h 10 h Limpar XILENO II 12 h 10 h Infiltração PARAfina I 12 h 11 h Infiltração PARAfina II 12 h 11 h Incorporação Parafina Tabela 7: Protocolo de processamento de tecidos ABB. Região H&E VIOLETA CRESIL LFB GALLYAS 4G8 AT8 α-SYN TDP-43 Neun GFAP Tronco cerebral Núcleo Motor Dorsal Medulla de Vagus X X X Pons – Locus Coeruleus X X X Midbrain – Substantia Nigra X X X X Cerebelo Córtex cerebelar e núcleo dentato X X X X Cérebro Giro frontal médio X X X X X X X Gânglio basal de Meynert X X X X X X Cingulado, anterior X X X X X X X Amígdala X X X X X X Núcleo tálamo e subtalâmico X X Giros temporais superiores e médios X X X X X X X X X Córtex hipocampo e entorhinal X X X X X X X X X X Lobule parietal inferior X X X X X X X Córtex occipital X X X X X Lâmpada olfativa X X Tabela 8: Regiões avaliadas, coloração e imunohistoquímica.

Discussion

Passos críticos no protocolo
Nosso objetivo é obter, caracterizar e armazenar tecidos de boa qualidade provenientes de sujeitos com histórico detalhado derivados da observação longitudinal. Para alcançar esse objetivo, é necessário lidar com os seguintes aspectos-chave. Como descrito acima, o protocolo começa com o recrutamento de doadores, que é o primeiro passo crucial. Então, é necessário que os doadores continuem o programa de acompanhamento e mantenham a adesão ao projeto ao longo do tempo até a doação real do cérebro. No momento da morte, é necessário que a equipe da ABB seja prontamente notificada para convocar a equipe de autópsia no prazo de 24 horas, sendo importante para a qualidade adequada do tecido. O corte fresco dos hemisférios cerebrais requer uma mão firme e um treinamento específico. Para evitar danos celulares causados pelo congelamento lento e obter fatias de boa qualidade para o criostat e Omics, é importante que eles sejam congelados rapidamente. Considerando a velocidade de penetração da solução formalina (1 mm/hora), para preservar a antigenicidade tecidual, o tempo de imersão da única fatia é mantido no mínimo.

Solução de problemas do método
Para abordar as etapas críticas mencionadas acima, oferecemos a seguinte abordagem. Recrutamento de doadores e adesão aos acompanhamentos: Existem vários fatores que dificultam a doação cerebral, incluindo o medo de danificar a figura do corpo, pureza e integridade, ou a possibilidade de sentir dor após a morte. Alguns até temem que a autópsia possa ser realizada enquanto ainda estão vivos⁷⁰^,⁷¹. Preocupações com a interrupção dos arranjos funerários e a carga financeira também estão presentes⁷². Além disso, a falta de conhecimento de um pessoal médico sobre procedimentos pós-morte e a incapacidade de lidar com as preocupações de potenciais doadores ou seu NOK podem desencorajar o registro. Todos esses fatores podem produzir um baixo nível de conscientização com um baixo número de participantes inscritos e uma alta possibilidade de perda de doadores ao longo do tempo. De fato, o programa de recrutamento de doadores deve ser eficiente na disseminação da conscientização, instilando confiança e convencendo as pessoas a se registrarem e manterem altas taxas de participação no seguimento. Em nossa experiência, isso é feito através de uma seleção cuidadosa de potenciais doadores e explicação minuciosa dos propósitos do BB. Oferecemos atividades educativas e uma abordagem empática abordando os medos e necessidades tanto das pessoas saudáveis quanto das afetadas com doenças neurodegenerativas e suas famílias. Descobrimos que doadores em potencial são mais propensos a dar seu consentimento quando abordados pessoalmente. Uma abordagem presencial cria uma relação baseada na confiança mútua e no respeito, fundamental para alcançar uma alta porcentagem de registro para doações cerebrais e avaliações de acompanhamento. Uma equipe altamente treinada com um forte senso de ética primeiro se aproxima do potencial doador, discute a possibilidade de doar o cérebro após a morte, explica o valor do tecido cerebral humano para a pesquisa neurocientífica e esclarece qualquer dúvida sobre procedimentos pós-morte. O boca a boca favorável é igualmente importante. Após a colheita cerebral, é dada a atenção e o cuidado adequados para recompor o cadáver. É importante mostrar respeito e gratidão à pessoa falecida tratando o cadáver suavemente. Alguns meses depois, uma reunião é agendada para comunicar os resultados da análise neuropatológica sempre que solicitado pelos familiares.

A hora da morte e a colheita cerebral: Quando a pessoa aceita, torna-se um doador e recebe um cartão de identificação com um número para entrar em contato 24 horas/dia, 7 dias/semana (o número de recepção do Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli que está ligado a nós). Além disso, uma etiqueta adesiva é dada aos familiares para serem utilizados em caso de internação. As agências funerárias da área foram previamente informadas para levar o corpo às instalações da ABB, onde a equipe de autópsia é convocada. A equipe de autópsia é composta por um patologista, um neurologista e/ou um neurobiólogo, e um técnico de sala anatômica, que estão de plantão das 6h às 23h todos os dias; alguns alunos estagiários também estão frequentemente presentes para ajudar e tirar fotos.

A precisão e consistência dos novos procedimentos de corte são garantidas pelo envolvimento dos mesmos dois operadores (um neurologista e um patologista) que desenvolveram o método e têm vários anos de experiência em neuropatologia. Ao congelar as fatias, elas são colocadas em uma bandeja de alumínio pré-congelada e cobertas com uma placa de alumínio entrelaçada para mantê-las bem planas. Imediatamente depois, são colocados em nitrogênio líquido por 3 minutos, antes de armazená-los a -80 °C. As fatias a serem fixadas são embrulhadas individualmente em gaze, e encharcadas em uma solução de formalina tamponada com fosfato de 10%, que é substituída após um dia. Posteriormente, são mantidos em formalina não mais do que 5 dias adicionais; no entanto, considerando que a solução formalina penetra a 1 mm/dia, gostaríamos de encurtar ainda mais o tempo de imersão.

Limitações do método
O método de pesquisa aqui descrito abrange apenas uma área geográfica limitada, e os indivíduos envolvidos no programa de doação possuem características que não representam inteiramente a população em geral. Embora mais do que aceitável, um intervalo pós-morte de até 24 horas pode produzir alterações em algumas estruturas proteicas, enzimas e RNA do tecido cerebral. A determinação do AFS e do pH pode não ser inteiramente adequada para determinar a qualidade do tecido⁷³ e estamos desenvolvendo outras formas de autenticar a qualidade do tecido com base na integridade do RNA.

Quanto ao procedimento de corte de microtómicos, embora muito útil para a reconstrução das relações anatômicas, deve-se notar que o uso de macrosecções não é simples e apresenta algumas dificuldades técnicas. Nosso método é desafiador e demorado. Os custos são bastante altos e o financiamento nem sempre é fácil. O financiamento vem principalmente de público (Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli) e recursos privados (Fundação Golgi-Cenci), doações privadas, organizações sem fins lucrativos (por exemplo, “Federazione Alzheimer Italia”) e doações.

A importância do método ABB em relação aos métodos existentes/alternativos
No início, nosso programa de doação cerebral tinha como alvo indivíduos participantes do estudo longitudinal InveCe.Ab. Como consequência, os cérebros doados são acompanhados de informações clínicas, biológicas e sociais detalhadas coletadas ao longo dos anos. A força da ABB deriva precisamente dessa origem distinta. De fato, estudar um grupo de pessoas social e geneticamente relacionadas que compartilham características biológicas e exposições ambientais melhora a análise estatística. Além disso, o estudo inclui os seguintes benefícios: 1) Cuidar e prover as necessidades da comunidade (o ato de “dar antes de pedir”): as pessoas recebem um check-up periódico gratuito do qual o clínico geral é informado, um número de telefone do nosso secretário é fornecido para consultas e pessoas com deficiência severa são visitadas em casa; 2) Engajar participantes, pessoas com funções públicas e clínicos gerais em atividades educativas por meio da organização de seminários periódicos (relacionados à saúde cerebral, doação de cérebros e saúde geral) e ao planejamento de cursos temáticos (por exemplo, o uso de dispositivos de tecnologia da informação para idosos); 3) Conhecer pessoas e adotar uma abordagem presencial. Todos esses elementos constituem a força do projeto ABB. Além disso, o projeto melhora as habilidades clínicas do pessoal médico envolvido, pois eles ganham experiência tanto em avaliações pré-mortetem quanto em avaliações neuropatológicas pós-morte. Nesse sentido, gostaríamos de mencionar a experiência muito peculiar do “Estudo de pesquisa sobre envelhecimento minoritário”. Este estudo envolveu um número limitado e selecionado de afro-americanos residentes na área de Chicago (784 dos 1.357 sujeitos elegíveis: taxa de resposta de 57%). Os participantes eram visitados anualmente em casa e eram convidados a participar do programa de doação de cérebros. Este estudo baseia-se em uma abordagem incomum com algumas semelhanças com a nossa obtendo altos percentuais de resposta positiva ao programa de doação cerebral (352 doadores de 784 participantes foram inscritos: 44%), embora a taxa de autópsia não tenha sido bastante satisfatória (53%)⁷⁴. Assim como no “The minority aging research study”, oferecemos atividades educativas e uma abordagem empática, alcançando excelentes resultados. Em particular, nossa taxa de resposta é de 93%, o percentual de matrícula é de 28,7%, e a taxa de autópsia no momento é de 67%. Essas taxas mostram que os projetos que envolvem diretamente as pessoas têm uma porcentagem mais substancial de doações. Outros programas de doação cerebral, com menos atenção na construção de uma relação com potenciais doadores, geralmente têm um baixo percentual de matrícula, sendo em torno de 10-15% ou menos⁷³^,⁷⁵.

Há poucos estudos anteriores de coorte terminando com uma análise neuropatológica. Além disso, a maioria dos bancos cerebrais e repositórios são centrados em doenças e há uma escassez de cérebros “controle” de doadores saudáveis em comparação com o número de cérebros “doentes”. Apenas um número limitado de BBs baseia-se em estudos populacionais envolvendo indivíduos doentes e normais para estudar as trajetórias de envelhecimento⁷³^,⁷⁴^,⁷⁶^,^77,^,^78,^,⁷⁹^,⁸⁰. Alguns estudos como “The minority aging research study” nos EUA⁷⁴ e “The Vantaa 85+ study” na Finlândia⁷⁶ são semelhantes aos nossos, mas tendem a acabar com o término da coorte. Em vez disso, o programa de doação da ABB deverá continuar por muito tempo no futuro, recrutando potenciais doadores e agendando acompanhamentos mesmo após o término do estudo longitudinal InveCe.Ab. Essa abordagem torna nosso método de recrutamento semelhante ao do “Sun Health Research Institute (SHRI) programa de doação cerebral” que é voltado para uma comunidade de^{aposentados 73}. O protocolo SHRI para doação cerebral é muito eficiente com o menor intervalo médio pós-morte do mundo (3,92 horas). Semelhante aos maiores BBs do mundo, o protocolo SHRI simplesmente cortou o cerebrum, cerebelo e tronco cerebral na linha média (plano sagital), então metade é dissecada fresca e congelada para estudos bioquímicos, enquanto a outra é fixada em formalina para a avaliação histopatológica. No entanto, um dos pontos fortes do protocolo de dissecação SHRI é a fixação de fatias individuais em vez de todo o hemisfério. De fato, fixar um hemisfério como um todo não é o ideal, devido aos diferentes gradientes de fixação entre a superfície e o núcleo. Além disso, as proteínas corticais podem ser afetadas pela exposição prolongada à solução formalina. Assim, a razão pela qual decidimos corrigir fatias individuais.

A decisão de qual lado é fixo ou congelado, depende do banco singular (sempre o mesmo, atribuído aleatoriamente ou atribuído dependendo se o dia da dissecação é ímpar ou mesmo)³¹^,³²^,^33,^,³⁴^,³⁵. Assim, a análise bioquímica e histopatológica é conduzida separadamente em cada hemisfério. Como muitas doenças neurológicas são assimétricas, nosso BB oferece um protocolo único para cortar espécimes frescos: seções alternativas do tronco cerebral e de cada hemisfério de cerebelo e cerebrum são retidos como material fixo ou congelado; uma fatia fixa em um hemisfério corresponde a uma congelada no outro hemisfério. Nosso método dá a oportunidade de obter uma caracterização histológica completa de todo o material congelado e comparar os resultados de todas as áreas de ambos os lados. Como dito na introdução, o método descrito nos permite obter o máximo de informações possível do tecido cerebral. Além disso, o método da ABB produz uma caracterização neuropatológica básica, mas completa, incluindo quase todas as proteinopatias cerebrais conhecidas e patologia vascular. Devido ao controverso papel das lesões vasculares na determinação do comprometimento cognitivo, decidimos utilizar uma pontuação dupla para a carga vascular³⁰^,⁵³.

Conforme explicado no protocolo, utilizamos uma abordagem multidisciplinar. Embora este seja um método demorado e trabalhado, acreditamos que ele fornece várias vantagens para a pesquisa. Por exemplo, em um trabalho anterior, demonstramos que o alto tHcy em si, ou MTHFR C677T TT associado ao alelo APOE-ε4, pode estar relacionado a disfunções executivas em vez de perda de memória⁸¹. Portanto, pode ser interessante avaliar indivíduos com esse perfil genético em particular a um nível neuropatológico. Este é um exemplo de como esse acompanhamento aprofundado é útil na criação de novas hipóteses de pesquisa verificáveis através da investigação de material biológico coletado em nosso banco. Outra demonstração da vantagem de nossa abordagem é a inclusão do QEEG entre as avaliações que realizamos rotineiramente, por sua originalidade e pela relativa facilidade de uso. De fato, o EEG detecta a atividade sináptica do córtex cerebral registrando os potenciais elétricos dos dendritos pertencentes aos neurônios piramixais cortical⁸². O QEEG pode ser considerado um biomarcador para estimativa da atividade sináptica cortical que está relacionada à cognição⁸³. Particularmente, uma diminuição dos ritmos alfa na parte posterior do cérebro com um aumento geral das frequências mais baixas (ritmos e delta) tem sido relacionada à quebra da conexão cortical. Deve-se considerar que a maioria dos estudos de correlação diagnóstica tem sido baseada em um diagnóstico clínico que é apenas um diagnóstico provável e não definitivo⁸⁴^,⁸⁵^,⁸⁶^,⁸⁷. Poucos estudos direcionados compararam os dados do QEEG com o quadro neuropatológico para investigar a correlação entre as variantes QEEG e LTS⁸⁸^,⁸⁹, e a distinção entre FTLD e AD⁸³. Ao encerrar nosso estudo com uma definição do diagnóstico neuropatológico, é então possível interpretar corretamente as observações feitas sobre a atividade elétrica cerebral. Além disso, realizando QEEG serial em cada sujeito podemos acompanhar a trajetória de ondas EEG intra-individuais e suas correlações com o quadro neuropatológico. Seguir modificações individuais da atividade elétrica cortical ao longo do tempo pode levar a uma melhor compreensão de seu significado como biomarcador para demência incipiente.

Aplicações futuras e direção do método
Implementar a distribuição de tecidos é um dos nossos principais objetivos prospectivos. Para isso, acabamos de criar uma comissão científica incluindo o diretor da Fundação GC (geriatra), um acadêmico de Neurologia da Universidade de Pavia, um neurologista e um patologista tanto da Fundação GC & do Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli. Ao distribuir tecido cerebral, lâminas histológicas e outras amostras biológicas, é importante lembrar que os doadores concordaram com a doação por causa da pesquisa. A distribuição do material deve, portanto, ocorrer com prudência, tal como descrito no Código de Conduta^{BNE 40}. Qualquer parte que apresente um pedido de material deve indicar o tipo e a quantidade da amostra necessária, fornecer uma descrição do projeto de pesquisa e como as amostras serão utilizadas e, sempre que possível, fornecer provas de publicações anteriores (para o contrato de transferência, ver Figura 9). O banco cerebral não funciona para ganhos financeiros. Assim, as taxas pagas pelos pesquisadores devem cobrir apenas as despesas de aquisição, processamento, armazenamento e distribuição de tecidos.

Planos para começar a analisar casos com sequenciamento exome e técnicas de Omics, como proteômica e transcrição, estão em andamento. Nossa metodologia de amostragem alternativa permitirá que estudos de omics sejam realizados em tecidos histologicamente bem definidos de ambos os hemisférios. Através dessa abordagem, será possível comparar o padrão de ativação genética em diferentes áreas cerebrais do mesmo hemisfério e nas áreas correspondentes do outro hemisfério, e ser capaz de correlacionar a ativação genética com a histopatologia. Neste campo, as aplicações de aprendizagem profunda seriam de grande interesse, incluindo análise informatizada de slides histológicos e correlação de ponta de dados clínicos, histológicos e omics. Outras correlações entre muitas variáveis diferentes podem ser identificadas, bem como outras possíveis aplicações tecnológicas. A disponibilidade de material congelado de ambos os hemisférios permitirá uma topografia precisa da ativação genética e distribuição de proteínas. Isso será de particular interesse até mesmo em indivíduos saudáveis, considerando que tanto as funções cerebrais quanto algumas doenças são assimétricas.

Além disso, podemos obter culturas celulares de doadores cerebrais bem caracterizados. De fato, culturas celulares das leptomeninges de cérebros colhidos fornecem células vivas que podem ser usadas para uma investigação mais aprofundada de doenças ou mecanismos de envelhecimento, por meio da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que envolve reprogramar fibroblastos leptomeningeais e diferenciá-los em células neurais em modelos avançados⁹⁰.

À medida que os cérebros envelhecem, diferentes perfis de mudança podem ocorrer no nível molecular, celular e tecidual. Cada cérebro é único. Cada um tem sua própria maneira de responder a estressores internos e externos; alguns resistem, enquanto outros sucumbem e exibem patologias distintas. Muitas vezes, existem discrepâncias entre a apresentação clínica e o quadro neuropatológico porque a topografia das lesões, e não sua natureza molecular, determina a apresentação clínica. O diagnóstico correto e definitivo só poderia ser alcançado combinando a síndrome clínica com os achados neuropatológicos que muitas vezes adicionam importantes pistas etiológicas necessárias para desvendar a patogênese das doenças. Na Europa, há um esforço para criar uma abordagem padrão para o diagnóstico neuropatológico. Nosso protocolo de diagnóstico segue quase completamente as diretrizes recentemente publicadas sobre diagnóstico neuropatológico para o brain banking⁹¹. Isso nos permitirá coletar e compartilhar tecido cerebral bem documentado, com o objetivo prospectivo de estabelecer o primeiro Banco Cerebral Italiano. De fato, na Itália há repositórios cerebrais, mas não bancos cerebrais baseados em estudos de coorte. Nosso objetivo é desenvolver um método de colheita de tecidos cerebrais que possa ser implementado amplamente em toda a Itália, para estabelecer uma rede que use um protocolo comum e compartilhe material comparável. Para isso, o envolvimento de outros centros de pesquisa e a criação de um site específico estão entre os principais objetivos para o futuro.

Tecnologias inovadoras estão sendo constantemente utilizadas para a análise da natureza molecular das doenças neurodegenerativas e para identificação de biomarcadores. Nesse contexto, haverá uma necessidade crescente de cérebros acompanhados de informações sobre trajetórias cognitivas e de envelhecimento obtidas por meio de estudos longitudinais, enfatizando a importância de uma abordagem epidemiológica neuropatologicamente verificada⁹².

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos dedicar este trabalho à Dra. Antes de morrer prematuramente, ela concebeu e começou o Projeto Abbiategrasso Brain Bank.

Somos gratos aos nossos doadores cerebrais, que estão generosamente contribuindo para a pesquisa doando o órgão mais nobre de seu corpo; sem eles esta pesquisa não seria possível.

Somos gratos a Valeria Marzagalli por seu precioso trabalho no projeto da ABB.

Os autores agradecem ao Prof. Johannes Attems, Dr. Paolo Fociani e Dr. Giorgio Giaccone por sua preciosa orientação e conselho sábio.

Gostaríamos de agradecer à Dra.
Muito obrigado à Sra. Tere Cassani pelo apoio e à “Federazione Alzheimer Italia” por sua colaboração.
Os autores agradecem ao Dr. Matteo Moretti e ao Prof. Antonio Marco Maria Osculati, Do Departamento de Saúde Pública, Medicina Experimental e Forense da Universidade de Pavia.

Materials

50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC

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