Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

Im Einklang mit der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution und dem BNE-Verhaltenskodex führt die ABB ihre Aktivitäten nach ethischen Standardsaus 39,40. Das Gehirnernteverfahren wurde der Ethikkommission der Universität Pavia im Rahmen der InveCe.Ab-Studie36vorgelegt und von ihr genehmigt. Die Studienverfahren entsprachen den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki von 1964 und den folgenden Änderungen. Das Einwilligungsformular ist vollständig und leicht verständlich. Die Teilnahme am Spendenprogramm ist eine persönliche Entscheidung, und es ist ein umfassendes Bewusstsein erforderlich. Wird eine Person nicht für befugt erachtet, das Einwilligungsformular zu unterzeichnen, ist die Zustimmung des Erziehungsberechtigten oder der Angehörigen (NOK) gerechtfertigt. Tabelle 2 berichtet über Inklusions- und Ausschlusskriterien für Hirnspenden. Die Forschung wurde unter der Aufsicht der Federazione Alzheimer Italia durchgeführt. 1. Rekrutierung für das Gehirnspendeprogramm Treffen Sie die Probanden, die Interesse an der Gehirnspende bekundet hatten, und ihren NOK und/oder Erziehungsberechtigten, um das Projekt (den Umfang des Spendenprogramms; den Prozess der Gehirnentfernung, Konservierung, Nutzung und Verteilung), das Recht, sich jederzeit aus dem Programm zurückzuziehen, den Schutz der Anonymität und die Folgestrategien vorzustellen. Besprechen Sie die Möglichkeit zusätzlicher Biomarker-Untersuchungen und Gentests. Beachten Sie die Wünsche des potenziellen Spenders oder seines NOK, über die Ergebnisse informiert zu werden. Erklären Sie alle wirtschaftlichen Aspekte, einschließlich des fehlenden finanziellen Gewinns sowohl für die Stiftung als auch für den Spender (Gehirne werden altruistisch gespendet und verteilt). Informieren Sie sie, dass ABB die Kosten für den Transport des Körpers übernimmt, während die Familie die Kosten der Beerdigung, Beerdigung oder Einäscherung übernimmt. Im Falle der Annahme, erhalten Sie die Unterschrift der Zustimmung zur Teilnahme am Spendenprogramm. Geben Sie dem Spender einen individuellen numerischen Code, um Anonymität zu garantieren. Notieren Sie sich die Identifikationsnummer der an der Längsstudie Beteiligten und geben Sie einen weiteren Code für die Gehirnbank an, um die beiden Untergruppen von Spendern (Teilnehmer oder Nichtteilnehmer an der Längsstudie; siehe Tabelle 3) einfach zu trennen. Geben Sie dem Spender einen Personalausweis, der seinen Status als Spender erklärt und die Telefonnummer (rund um die Uhr verfügbar) anzeigt, um die Brain Bank über seinen Tod zu informieren. 2. Spenderbewertung und serienmäßige Follow-ups HINWEIS: Es ist möglich, nur für einige und nicht für alle der unten genannten Prüfungen ihre Zustimmung zu erteilen. Alle klinischen Bewertungen werden vom selben Team durchgeführt, einschließlich eines Neurologen, eines Geriaters mit Expertise in der Neurologie und 3 Psychologen. Wenn sich neue Symptome entwickeln oder der kognitive Rückgang fortschreitet, kann das Zeitintervall zwischen den Follow-ups verkürzt werden. Wie im Fall der InveCe.Ab-Studie erhalten Sie einen Lifestyle-Sozialen Fragebogen, einschließlich Grad der Autonomie (ADL, IADL), persönlichen Gewohnheiten, sozialen und Lifestyle-Faktoren, die geistige Funktionen beeinflussen können. Sammeln Sie Familien-, medizinische und neurologische Geschichte mit Informationen über genetische, infektiöse, toxische, metabolische, Autoimmun-, Herz-Kreislauf-, Trauma-, degenerative, neoplastische und neurologische Erkrankungen. Sammeln Sie frühere klinische Untersuchungen und listen Sie pharmakologische Behandlungen auf. Führen Sie eine umfangreiche neuromotorische Bewertung einschließlich Tests für Die Hirnnervenfunktion, Fundus Oculi, Gesichtsfeld, Muskelkraft und Ton, Empfindlichkeiten, Sehnenreflexe, exterozeptive und primitive Reflexe, Meningeale Zeichen, Haltung, Gang, Bewegungen, Koordination, sphinkterische Funktionen, und jede Anwesenheit von fokalen oder Babinski Zeichen. Bewerten Sie Sprache, mentalen Status und jede Verhaltensänderung. Führen Sie eine umfassende neurokognitive Bewertung einschließlich globaler Kognition und eine vollständige neuropsychologische Bewertung bestimmter kognitiver Bereiche durch: verbales und visuelles Gedächtnis, Aufmerksamkeit, psychomotorische Geschwindigkeit, Sprache, semantisches Gedächtnis, Exekutivfunktionen und visuospatiale Fähigkeiten(Tabelle 4 für Details). Betrachten Sie das Vorhandensein von Depressionen (CES-D-Skala). Erhalten Sie eine Blutprobe, die sowohl für die Blutchemieanalyse (Tabelle 5) als auch für die Isolierung und Speicherung von DNA, Plasma und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) verwendet wird. Bestimmen Sie die APOE-Genotypisierung (rs429358 und rs7412) (eine umfassendere genetische Profilierung wurde in InveCe.Ab-Teilnehmern ermittelt; siehe Tabelle 6). Registrieren Sie ein EKG (Herzveränderungen, Vorhofflimmern) und ein RuhezustandSelektroenzephalogramm für die quantitative Analyse (QEEG). Betrachten Sie optionale Biomarker-Tests, einschließlich Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) TAU, Phospho-TAU und Amyloid, und Gehirn-Bildgebung (MRT zum Nachweis von In-vivo-Degeneration, Ischämie oder Entzündung; FDG-PET zur Erkennung von Stoffwechselversagen; PIB-PET zum Nachweis der Hirnamyloidose im Zusammenhang mit der Pathophysiologie von Alzheimer). Planen Sie das anschließende Check-up-Programm des Hirnspenders. Richten Sie die Zeitintervalle nach verschiedenen Altersgruppen ein (bis 64 Jahre: alle 10 Jahre, 65-74 Jahre: alle 3 Jahre, ab 75 Jahren: alle 2 Jahre). Weisen Sie eine klinische Diagnose und/oder eine neurokognitive Diagnose nach DSM-V zu. Klassifizieren Sie die klinische Demenz-Inszenierung mit dem Klinischen Demenz-Rating (CDR)-Score. Aktualisieren Sie CDR in der letzten Periode vor dem Tod. Bereiten Sie eine Datenbank grafisch ähnlich der Papierdatenbank vor. Fügen Sie alle gesammelten Daten in die Brain Bank-Datenbank ein. Planen Sie eine Überarbeitung durch einen anderen Sachbearbeiter, um fehlerbetätigt zu werden. 3. Zeitpunkt des Todes und der Hirnentfernung HINWEIS: Das italienische Gesetz legt fest, dass Asystole länger als 20 min dauern muss, um den Tod zu bestätigen. Die Registrierung eines flachen Elektrokardiogramms (EKG) für mindestens 20 min (genannt Thanatographie) ermöglicht eine Autopsie innerhalb von 24 h nach dem Tod (DPR 285/90 Art. 8 und Gesetz Nr. 578 29. Dez 29, 1993). Eine postmortale Zeit von 30 h wird die Autopsie abgebrochen (siehe Tabelle 2). Das Autopsieteam besteht aus einem Pathologen, einem Neurologen und/oder einem Neurobiologen, einer Krankenschwester, einem anatomischen Raumtechniker und allen Praktikanten; die ersten beiden Teammitglieder führen auch die neuropathologische Diagnose durch. Bei der Handhabung und Zerlegung des Kadavers ist die Verwendung geeigneter Kleidung (Mantel, Handschuhe, Brille und Haarnetz) obligatorisch. In diesem Abschnitt beschreiben wir die wichtigsten Werkzeuge und Geräte, die normalerweise in unserem Labor verwendet werden. Die Leser können die Instrumente wählen, die nach eigenem Ermessen verwendet werden sollen. Eine detaillierte Beschreibung der hier verwendeten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien. Stellen Sie sicher, dass die von der Familie gewählte Bestattungsgesellschaft den Leichnam in die ABB-Einrichtungen bringt. Führen Sie die Thanatographie durch, bei der die Herzaktivität fehlen muss. Wenn ja, unterschreiben Sie eine Sterbeurkunde und beginnen Sie mit der Autopsie. Transportieren Sie den Kadaver zum Autopsieraum. Messen Sie den Umfang des Schädels auf der Ebene des breitesten Teils des Kopfes. Messen Sie von der Nasion bis zur Inion, um den Anteroposteriordurchmesser (APD) zu erhalten, während der Abstand von einem Ohr zum anderen den Querdurchmesser (TD) ergibt. Berechnen Sie den Cephalic Index (CI) mit der Formel: CI = TD/APD x 100. Mit einem scharfen Skalpell, machen Sie einen Kopfhautschnitt auf der koronalen Ebene, von der Spitze des Mastoid-Prozesses auf einer Seite zur anderen, über den Scheitelpunkt. Haare, Haut und Unterhautgewebe durchschneiden und die beiden Falten der Kopfhaut vorsichtig vom darunter liegenden Schädel trennen. Führen Sie den Schnitt aus, bis das gelbe supraorbitale Fett sichtbar wird und die Kopfhaut anterior reflektiert. Ziehen Sie den anderen Teil nachtränk. Mit Skalpell und Zange, nehmen Sie eine kleine Probe des zeitlichen Muskels an jeder Seite, legen Sie eine in 4% Formaldehyd und gefrieren die andere (siehe Abschnitt 7). Schneiden Sie den Schädel mit einer elektrischen Säge nach einem V-Schnitt auf der Vorderseite. Entfernen Sie die Schädelkappe und schneiden Sie die Meninges. Probenstücke von Dura sind sowohl in 4% Formaldehyd fixiert als auch gefroren (siehe Abschnitt 7). Erhalten Sie ca. 10 ml CSF, indem Sie eine 20 G 3,5-In-Nadel durch das Corpus callosum einsetzen, um den dritten Ventrikel zu erreichen. Bewerten Sie das Aussehen, die Farbe und die Trübung von CSF und messen Sie den pH-Wert. Dann 10 Aliquots von jeweils etwa 1 ml machen und bei -80 °C aufbewahren. Heben Sie das Gehirn zart ziehen an beiden Frontallappen und schneiden Sie sowohl Die Sehnerven infundibulum, die inneren Karotisarterien (ICA) und die dritte, vierte, fünfte und sechste Hirnnerven. Schneiden Sie das Tentorium, um die hintere Fossa zu erreichen und schneiden Wirbelarterien und unteren Schädelnerven. Legen Sie das Skalpell so tief wie möglich durch das Foramen magnum, um den kaudalsten Teil der Medulla zu schneiden. An diesem Punkt, entfernen Sie das gesamte Gehirn sanft. Mit dem Skalpell den Knochen über Meckels Höhle durchbohren und das Gasserische Ganglion von beiden Seiten erhalten. Fixieren Sie ein Ganglion in 4% Formaldehyd und frieren Sie das andere ein (siehe Abschnitt 7). Fraktur ieren Sie die knöcherne sella turcica mit einem chirurgischen Schlägel und Meißel, um die Hypophyse zu entfernen und dann fixieren Sie es in 4% Formaldehyd. Überprüfen Sie den Schädel und das gesamte Gehirn auf makroskopische Veränderungen und Gefäßveränderungen. Mit einem Maßband messen Sie das Gehirn, um den Quer- und Anteroposteriordurchmesser zu erhalten. Holen Sie sich mit Sorgfalt den Kreis von Willis und bewerten Sie ihn makroskopisch (Abbildung 2E) für das Vorhandensein von anatomischen Varianten, Läsionen oder Gefäßstenose. Nehmen Sie 1–2 Stück Leptomeningen von 2–4 cm2 aus der Konvexität und bewahren Sie sie in vollständig hoher Glukose Dulbecco modifizierte Eagle Media (DMEM) Kulturmedium bei 4 °C mit 20% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Pen/Strep, 1% Glutamin und 1% nicht-essentielle Aminosäuren Aminosäuren Amino (wie zuvor veröffentlicht, mit einigen Modifikationen)41. Um Fibroblastenkulturen zu erhalten, legen Sie die Leptomeningen auf eine 10 cm Petrischale und waschen Sie sie zweimal mit Phosphatpuffer-Saline (PBS), wobei die Flüssigkeit jedes Mal entsorgt wird. Mit einem Skalpell und einer Pipettenspitze die Leptomeningen in kleine Stücke von ca. 2 oder 3 mm schneiden, 3–4 Stück in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte säen, die zuvor mit Gelatine für 0,5% beschichtet war, und jeden Brunnen mit 2 ml komplettem Medium füllen, das mit 1% Amphotericin B ergänzt wird (die Verarbeitung in einem Biosicherheitsschrank durchführen, um die Sterilität der Kultur zu gewährleisten). Legen Sie die Platte in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für mindestens eine Woche und ändern Sie das Medium alle 3–4 Tage. Trypsinize Zellen mit sterilem 1x Trypsin, wenn der Brunnen bei etwa 70% des Zusammenflusses ist. Leptomeningeale Fibroblasten in einen T75-Kolben geben und mit 12 ml komplettem Medium füllen. Nach 5 Tagen versuchen und konservieren sie in 900 l FBS und 100 l Dimethylsulfoxid (DMSO). Trennen und inspizieren Sie Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm und gewichten Sie sie einzeln. Nehmen Sie die Zirbeldrüse ab und fixieren Sie sie in 4% Formaldehyd. Entfernen Sie olfaktorische Glühbirnen und Sehnerven, und fixieren oder einfrieren Sie eines von jedem Paar, unabhängig von der Seite. Halten Sie das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm in Eis bei 4 °C für mindestens 2-4 h, bis sie für die Zerlegung bereit sind, um Gewebestörungen zu minimieren und die Weichheit des Gewebes zu reduzieren. Achten Sie nach der Ernte auf den Kadaver. Befestigen Sie den Knochen mit einem Super-Klebstoff klebern, und nähen Sie die Kopfhaut mit einer chirurgischen Nadel und nicht resorbierbaren Nähten zurück. Zeigen Sie dem Verstorbenen Respekt und Dankbarkeit, indem Sie den Kadaver sanft behandeln. Reinigen und rasieren Sie das Gesicht, und waschen und trocknen Sie das Haar, weil der Kadaver in einem offenen Sarg für die Lieben sichtbar gelegt werden.HINWEIS: Die Neuzusammensetzung des Kadavers erfolgt durch einen Techniker. Das Protokoll kann hier angehalten werden. 4. ABB-Sezierprotokoll HINWEIS: Derselbe Pathologe und/oder Neurologe schneidet Hirnstamm, Kleinhirn und Großhirn unter eine Dunstabzugshaube. Ein Neurobiologe ordnet die Scheiben nach dem Schneiden an. Ein Praktikant, der sich nicht mit Hirnabschnitten befasst, dokumentiert das gesamte Verfahren mit Fotos, die in die Datenbank hochgeladen werden sollen, um in den nachfolgenden Gewebeverarbeitungsphasen als Leitfaden zu dienen. Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Trennmesser axial ab und machen Sie den ersten Schnitt auf der Ebene des rostralen Mittelhirns durch den überlegenen Colliculus, um zwei Scheiben zu erhalten, die die Substantia nigra (SN) aussetzen. Machen Sie den Rest der Schnitte, um 8 mm Hirnstammscheiben zu erwerben, um etwa 10 Abschnitte zu erhalten. Achten Sie darauf, Schnitte, die durch die rostralen Pons in der Nähe der oberen Ränder des vierten Ventrikels gehen, um den Lokus coeruleus (LC) zu beobachten, und durch die Medulla oblongata, die der akustischen Striae knapp über der unteren Spitze des vierten Ventrikels unterlegen ist, um Scheiben einschließlich des dorsalen Motorkerns des Vagus (DMNV) zu haben. Nennen Sie alle Slices im rostrocaudalen Sinne als BS (Brainstem) gefolgt von arabischen Zahlen, um die Abschnitte zu identifizieren. Verwenden Sie nach dem letzten Hirnstammabschnitt die Bezeichnung SC (Spinalcord), gefolgt von den Zahlen 1–n. Je nach Anzahl der entfernten Spinal-Meamer werden etwa 2–4 SC-Scheiben erhalten (Abbildung 2H–I). Beschriften Sie alle Abschnitte, die korrigiert oder abwechselnd eingefroren werden sollen, und nehmen Sie ein Bild für das Fotoarchiv auf (Abbildung 2). Fixieren und einfrieren Sie dann alle Slices wie unten beschrieben (Schritte 4.7 und 4.8). Schneiden Sie das Kleinhirn auf der sagittalen Ebene, um die beiden Kleinhirnhalbkugeln auf der Ebene der Vermis zu trennen. Führen Sie sagittale Schnitte durch, um 5 Scheiben aus jeder Hemisphäre zu erhalten (Abbildung 2F–G). Benennen Sie alle Slices aus vermis als CBR oder CBL (für rechtes bzw. linkes Kleinhirn) und verwenden Sie arabische Zahlen, um die Abschnitte zu identifizieren. Beschriften Sie alle Abschnitte, die abwechselnd fixiert oder eingefroren werden sollen, und machen Sie ein Foto für das Archiv (Abbildung 2). Fixieren und frieren Sie dann alle Slices wie unten beschrieben ein. Trennen Sie die beiden Hemisphären des Großhirns durch den Corpus callosum (Abbildung 2A-B) und schneiden Sie sie einzeln auf der koronalen Ebene. Machen Sie den ersten Schnitt in einer Ebene, die zwischen dem optischen Chiasm und den Brustkörpern, durch Frontallappen, Temporalpol, vordere Cingulate, vordere Kommissure, Kern von Meynert und Basalganglien. Führen Sie den zweiten Schnitt ca. 1 cm hinterder Weise durch die Brustkörper und die Basalganglien, vorderen Thalamus, Subthalamus und Amygdala aus. Fahren Sie fort, um die vorderen und hinteren Bereiche zu sezieren, um 1 cm Scheiben zu erwerben, um 15 bis 20 Abschnitte für jede Hemisphäre zu erhalten. Legen Sie die Scheiben auf eine flache Oberfläche. Legen Sie sie ihrer ursprünglichen Position in anteroposterior Richtung, von der Front bis zum Okzipitalpol, mit dem Abschnitt kontinuierlich mit der vorherigen Scheibe nach oben. Durch den Vergleich der Abschnitte aus beiden Hemisphären wählen Sie alternative Abschnitte aus jeder Halbkugel aus, die als festes oder gefrorenes Material beibehalten werden sollen. Erkennen Sie die Hauptabschnitte, die für die Histopathologie fixiert und verarbeitet werden sollen, einschließlich frontaler und zeitlicher Lappen, Cingulate, Basalganglien, Nucleus basalis von Meynert, Amygdala, Thalamus, Hippocampus und entorhinaler Kortex, okzipito-temporaler Gyrus, parietalen und okzipitalen Lappen. Nennen Sie alle Slices im anteroposterior en Sinn als L (links) oder R (rechts) gefolgt von arabischen Zahlen und setzen Sie ein Etikett, das angibt, ob das Segment fixiert oder eingefroren werden soll (Abbildung 2A–D). Um die Abschnitte zu identifizieren, machen Sie ein Bild für das Fotoarchiv. Fixieren und einfrieren Sie dann alle Slices, wie in den Abschnitten 7 und 8 beschrieben. 5. Hirn- und Gefäßinspektion und makroskopische pathologische Bewertung (mit bloßem Auge) Führen Sie eine allgemeine makroskopische Untersuchung unter Berücksichtigung von Meningealveränderungen, diffuser oder lokalisierter kortikaler Atrophie, Hippocampusatrophie, ventrikulärer Vergrößerung, Kleinhirnatrophie, Hirnstammatrophie, Substantia nigra pallor, Veränderungen der weißen Materie (Typ und Ort angeben). Untersuchen Sie den Kreis von Willis unter Berücksichtigung von Arteriosklerose und Okklusion. Zuweisen Der Punktzahl = 1 in Gegenwart von Atherom ohne Stenose von mehr als 50%, Score = 2 wenn mindestens eine Arterie 50% oder mehr okkludiert ist, Score = 3, wenn zwei oder mehr Arterien 50% oder mehr okkludiertsind 42. Bewerten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Pathologie in anderen intrakraniellen Gefäßen. Um parenchymale Gefäßläsionen zu erkennen, untersuchen Sie Gehirnhälften, Kleinhirn und Hirnstamm. Berücksichtigen Sie lacunare Läsionen (Durchmesser 10 mm). Wenn vorhanden, geben Sie größe in Millimeter, Zahl und Position an. Berücksichtigen Sie auch das Vorhandensein oder Fehlen von subarachnoiden Blutungen. 6. Gewebequalitätskontrolle HINWEIS: Die Agonal Factor Score (AFS) liegt zwischen 0 und 2 und ist wichtig für die Bewertung der Gewebequalität. Um AFS zu bestimmen, betrachten Sie klinische Bedingungen, die um den Zeitpunkt des Todes auftreten (insbesondere Bedingungen, die Gehirnazidose bestimmen) und die Dauer des Agonalzustandes (plötzlicher Tod oder längere Qual). Wenn AFS > 1, das Gehirngewebe möglicherweise nicht von optimaler Qualität43. Berücksichtigen Sie auch Gehirn und CSF pH; Wenn pH < 6, das Gehirngewebe möglicherweise nicht von optimaler Qualität43,44. Überprüfen Sie, ob der Tod durch Erkrankungen verursacht wurde, die Hirngewebe wie Hypoxie, langwierige Azidose, mechanische Beatmung, Multiorganversagen, hohes Fieber, schweres Schädeltrauma, Einnahme neurotoxischer Substanzen, schwere Dehydrierung, schwere Hypoglykämie, epileptischen Zustand und längeres Koma schädigen können. Wenn eine dieser Bedingungen vorhanden ist, weisen Sie 1 Punkt zu. Überprüfen Sie die Dauer des Agonalzustandes(schnell, wenn der Tod innerhalb von 1 h auftritt, Zwischenwenn der Tod zwischen 1 und 24 h auftritt, langsam, wenn der agonale Zustand länger als 1 Tag dauert). Wenn ein zwischengeschalteter oder langsamer Tod eintritt, weisen Sie 1 Punkt zu. Berechnen Sie den AFS-Wert und messen Sie den CSF-pH-Wert anhand einer Elektroden-pH-Nadel und eines pH-Gewebes durch ein pH-Messgerät auf einer Oberflächen-pH-Meter auf einer Hirnscheibe aus jedem Lappen und auf einem Kleinhirnabschnitt. 7. Einfrieren des Gewebes Halten Sie alle Gewebe in Eis bei 4 °C gefroren werden. Dann frieren Sie sie schnell ein. Legen Sie sie auf ein vorgefrorenes Aluminiumfach. Abdeckung mit einer ineinandergreifenden Aluminiumplatte, um sie flach zu halten. Legen Sie sie in flüssigen Stickstoff bei -120 °C für 3 min. Legen Sie die Scheiben in eine Plastiktüte, die mit dem entsprechenden Identifikationscode und der entsprechenden Scheibennummer beschriftet ist. Teilen Sie die Plastiktüten in drei kryogene Boxen (für rechte Hemisphäre, linke Hemisphäre und Hirnstamm) und lagern Sie bei -80 °C. 8. Gewebefixierung Die Scheiben nacheinander in Gaze wickeln und die Scheiben in 10% Phosphat gepufferte Formalinlösung legen. Nach 1 Tag die formalinLösung durch eine frische Lösung ersetzen. Lassen Sie sie für ca. 5 Tage in einem kalten Raum bei 4 °C. Alle Scheiben als Ganzes aufbewahren und nur die Scheiben, die Hippocampus und Amygdala enthalten, in zwei Teile teilen (Abbildung 3). Der obere Teil beider Scheiben enthält den Frontallappen (R10a–L9a in Abbildung 3); die unteren Teile enthalten jeweils: (1) Amygdala, Temporallappen und Basalganglien (L9b in Abbildung 3B) und (2) Hippocampus und einen Teil des Temporallappens (R10b in Abbildung 3A). Dies geschieht, um die Beziehung zwischen den verschiedenen Strukturen aufrechtzuerhalten. Legen Sie alle Abschnitte mindestens 2 Tage in den Phosphatpuffer, um Kreuzverknüpfungsprodukte auszuwaschen und zu entfernen.HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. 9. Dehydrierung, Räumung, Paraffineinbettung und Diavorbereitung Bereiten Sie steigende Konzentrationen von Ethylalkohol von 70% bis 100%, Xylol und zwei Sätzen geschmolzenem Paraffinwachs vor. Legen Sie die Gehirnabschnitte in den automatischen Prozessor für Dehydrierung, Clearing-Verfahren und Paraffin-Infiltration (verwenden Sie zwei verschiedene Gewebeverarbeitungsprotokolle für Makro (Zerebrum und Kleinhirn-Scheiben) und Mikroproben (Gehirnstamm-Slices und die anderen kleinen Proben); Tabelle 7). Das Gewebe in Paraffinwachs auf einer Metall- oder Kunststoffform einbetten. Wählen Sie die Abschnitte aus, die geschnitten werden sollen, um alle Interessengebiete zu bewerten, die den Montine-Index für die neuropathologische Charakterisierung45 anwenden (Tabelle 8). Schneiden Sie dann die ausgewählten Abschnitte in scheiben. Verwenden Sie ein Schlittenmikrotom für Makrosektionen und ein Drehmikrotom für kleine Abschnitte. Schneiden Sie 5 ‘m Scheiben für Haematoxylin und Eosin (H&E) Färbung und 8 ‘m Scheiben für die anderen Färbungen und Immunhistochemie. Legen Sie die Scheiben auf drei verschiedene Arten von histologischen Dias: 8,5 cm x 11 cm für die größten Scheiben, 5 cm x 7,5 cm für mittlere Scheiben und die klassischen 2,5 cm x 7,5 cm für kleinste.HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. 10. Deparaffinierung, histologische Färbung und Immunhistochemie (IHC) Führen Sie die Deparaffinierung durch, um eine Reaktion mit wässrigen Farbstofflösungen zu ermöglichen. Führen Sie es mit Xylol und abnehmender Alkoholkonzentration (5 min für jeden Schritt). Rehydratisieren Sie 5 min mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie die folgenden histologischen Färbungen, um architektonische und strukturelle Gewebeanomalien und zelluläre Morphologie zu bewerten: H&E (für vaskuläre mikroskopische Läsionen und Entzündungen), Cresyl Violet (NISSL; für neuronalen Verlust), Luxol Fast Blue (LFB; für Demyelination), Gallyas (für neuritische Plaques und Neuropil-Threads). Verwenden Sie die Immunhistochemie (IHC), um das Vorhandensein spezifischer Zielstrukturen hervorzuheben. Anti-NeuN und Anti-GFAP werden verwendet, um neuronale und gliale Kompartimente zu identifizieren; 4G8, AT8, ‘-SYN und TDP-43 werden verwendet, um Proteine zu identifizieren, die sich bei neurodegenerativen Erkrankungen aggregieren (Tabelle der Materialien). Pretreat entwachste Abschnitte mit 3% H2O2 für 10 min dann in PBS abspülen. Durchführung einer Retrieval-Behandlung mit Citratpuffer 0,01 Mio. pH 6 (seriell für 2, 1 und 2 min) für 4G8-, SYN-, TDP-43- und NeuN-Antigene; 70% Ameisensäure für 4G8 und Vorinkubieren für 30 min in 5% normalen Ziegenserum. Über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubieren. Am Tag danach die Abschnitte in PBS vor der Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Envision+ System-HRP mit Polymer) bei einer Verdünnung von 1:2 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur abspülen. Waschen Sie mehrmals in PBS und inkubieren Sie in Chromogensystem mit Diaminobenzidin (Liquid DAB+Substrate Chromogen System) mit Blick auf die Reaktionsentwicklung unter dem Mikroskop (Vergrößerung 4–10x). Waschen Sie schließlich die Abschnitte in PBS. Gegenbeflecken Sie die Abschnitte in Hämatoxylin, dehydrieren und abdeckfest mit DPX-Montage.HINWEIS: Tabelle 8 fasst das Standardprotokoll zusammen. Führen Sie H&E-Färbung auf allen Abschnitten durch, während spezielle/spezifische Flecken und Reaktionen auf ausgewählten Abschnitten verwendet werden. Ausgewählte Fälle erfordern zusätzliche Bereiche oder Reaktionen. Die Materialtabelle zeigt die Details der Antikörper, die für IHC verwendet werden. 11. Grundlegende neuropathologische Charakterisierung HINWEIS: Unspezifische Hirngewebeveränderungen, Gefäßpathologie, Alzheimer-Krankheit (AD) Pathologie, Nicht-AD-TAUopathien, Synukleinopathien, TAR-DNA-bindende Protein (TDP-43) Pathologie und hippocampale Läsionen werden untersucht. Ein an eine Kamera angeschlossenes optisches Mikroskop wird verwendet, um parenchymale mikroskopische Läsionen zu erkennen. Die histologische Beurteilung wird von demselben Team von geschultem Personal in der Neuropathologie durchgeführt, darunter ein Professor für Neurologie, ein Neurologe und ein Pathologe. Es basiert auf einem modifizierten Montine-Ansatz45 (Tabelle 8) auch: (1) Heterogene nicht-AD-TAUopathien, die das pathologische Kennzeichen der Fronto-Temporal Lobe Degeneration (FTLD) im Zusammenhang mit TAU-Ablagerungen darstellen: Pick-Krankheit, nicht fließende primäre progressive Aphasie (TAU-nfPPA), Progressive Supranuclear Palsy (PSP)46,47 und Cortico-Basal Degeneration (CBD)48. Darüber hinaus umfassen Nicht-AD-TAUopathien Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Altern und ohne definitive klinische Bedeutung wie primäre altersbedingte TAUopathie (PART)49, Altersbedingte TAU Astro-Gliopathie (ARTAG)50, argyrophile Kornerkrankung48. (2) Lewy Type Synucleinopathy (LTS), die mit der Parkinson-Krankheit (PD) und Lewy Bodies Demenz (LBD) zusammenhängt. Um nach LTS zu suchen, wenden Sie die folgenden hierarchischen Schritte an: zunächst Olfaktor, Hirnstamm, Amygdala/TemporalKorte; wenn die vorherigen Bereiche positiv sind, fügen Sie limbische Strukturen (Hippocampus-Bildung, entorhinalen Kortex, vordere cingulate), mittleren frontalen Gyrus, minderwertige parietale Lobule und okzipitalen Kortex45hinzu. Wenn klinische Merkmale von kortikaler LBD vorhanden sind (d. h. Schwankungen und/oder Halluzinationen), berücksichtigen Sie limbische Strukturen und Isocortex für den ersten Schritt. (3) TDP-43-Ablagerungen, das pathologische Kennzeichen von FTLD im Zusammenhang mit TDP-43-Ablagerungen: Verhaltensvariante der Fronto-Temporalen Demenz (bvFTD), Semantische Demenz (SD oder svFTD), TDP-nfPPA und FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). Der IHC für TDP-43 wird auf den folgenden Abschnitten durchgeführt: Amygdala, Hippocampus, entorhinaler Kortex und mittlerer frontaler Gyrus; in Fällen mit Verdacht auf klinische FTLD, erwägen, andere Abschnitte zu untersuchen51. Bewerten Sie unspezifische Hirngewebeveränderungen in ausgewählten Abschnitten mit H&E, NISSL, LFB und IHC für GFAP und NeuN. Betrachten Sie neuronale Seltenheit, ballonierte Neuronen, Spongiose, Gliose, Myelinverlust, das Vorhandensein oder Fehlen von entzündlichen oder tumoralen Infiltraten. Geben Sie die vorherrschende Position dieser Änderungen an. Um mikroskopische Gefäßläsionenzu erkennen, untersuchen Sie H&E- und LFB-Dias mit mindestens zwei hemisphärischen Makroabschnitten (die ersten durch die Brustkörper (Charcot-Schnitt) mit frontalen und zeitlichen Lappen, Basalganglien, vorderer Thalamus, Amygdala und der zweite Durchgang durch den okzipitalen Lappen, den “genulaten” Abschnitt der Hippocampusbildung, einen Kleinhirnabschnitt und alle drei Hauptabschnitte des Hirnstamms (durch substantia nigra, locus coeruleus und DMNV). Erkennen Sie kleine Gefäßerkrankungen wie Arteriolosklerose, Lipohyalinose, perivaskuläre Raumdilatation, Verlust der weißen Materie, leptomeningeale und/oder parenchymale und/oder kapillare zerebrale Amyloid-Angiopathie. Geben Sie die Benotung (0–3) und die vorherrschende Position42,52 an. Betrachten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Hemosiderin Leckage, Mikroblutungen und Mikroinfarkte. Bewerten Sie den Beitrag von Gefäßschäden zu kognitiven Beeinträchtigungen anhand des hierarchischen Deramecourt-Schemas (Gefäßwandveränderungen – kleine Gefäßerkrankungen – makroskopische Infarkte). Für diese Bewertung betrachten Sie einen frontalen und zeitlichen Lappenabschnitt, Basalganglien und Hippocampus (Score 0–20)30. Schätzen Sie auch die Wahrscheinlichkeit, dass zerebrale Gefäßerkrankungen zur kognitiven Beeinträchtigung beigetragen haben, indem Sie den VCING-Score (low-intermediate-high) verwenden, der durch die Berücksichtigung hemisphärischer makroskopischer Infarte und kleiner Gefäßerkrankungen des okzipitalen Lappens einschließlich mittelschwerer bis schwerer Arteriolosklerose und Amyloid-Angiopathie53erzielt wurde. Bewerten Sie die AD-Pathologie mit IHC (4G8) für die Amyloidausbreitung. Definieren Sie Thals Stufen (1–5)54, Aggregat Amyloid-Scoring (0–3)45und Morphologie pro Standort (diffus, fokal, entkernt). Bewerten Sie die AD Tau Pathologie mit IHC (AT8) und beschreiben Sie die vorherrschende Morphologie pro Standort (neurofibrilläre Verwicklungen, Neuropilfäden, neuritäre Plaques). Definieren Sie Braaks Stufe (I–VI +; positives Zeichen zeigt das Vorhandensein von zusätzlichen Bereichen der hyperphosphorylierten Tau-Pathologie an, die nicht der Braak-Hierarchie folgen)55 und Aggregat-Scoring (0-3)45. Bewerten Sie neuritische Plaques mit Gallyas Färbung und CERAD-Score (0–3)56. Definieren Sie dann die Wahrscheinlichkeit der neuropathologischen Merkmale, Adie einem AD-Klinischen Syndrom entsprechen, mit dem A-Myloid-B-Raak-BC-ERAD-Score (ABC-Score 0–3): none-low-intermediate-high45.C score Verwenden Sie AT8 IHC, um das Vorhandensein oder Fehlen von nicht-AD TAU Pathologie angeben vorherrschende Nkung und seltsame morphologische Bild zu bemerken. Betrachten Sie neuronale Einschlüsse wie flammenförmige oder kugelförmige Verwicklungen, kugelkugelförmige Einschlüsse (d. h. Picks Körper)57, Neuropil-Threads, dystrophische Neuriten, argyrophile Körner; und gliaale Einschlüsse wie getuftete Astrozyten, dornige Astrozyten, astrozytische Plaques, gewickelte Körper, kugelförmige Einschlüsse58,59. Verwenden Sie den IHC von Syn,h, um LTS (Lewy-Körper, blasse Körper und Lewy-Neuriten) an den Bereichen in der obigen Notiz zu erkennen. Im Falle der Positivität, wenden Sie McKeiths Einstufung (0-4) auf, um die Schwere der Läsionen60zu bewerten; verwenden Sie dann Beachs Stadien (I–IV) für die topographische Verteilung (Olfaktorbirne, Hirnstamm vorherrschend, limbisch vorherrschend, neokortikal)61. Vergleichen Sie die Stadien von Beach und Braak, um die Beziehung zwischen LBD und AD Pathologie60,61,62zu definieren. Betrachten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Glial Cytoplasmic Inzinzien (GCI; nicht Lewy-Typ Glialsynuklenopathie), die das pathologische Kennzeichen der Multiple System Atrophie (MSA) sind und geben Sie ihre vorherrschende Position63an. Verwenden Sie TDP-43 IHC, um TDP-43-Ablagerungen auf den Bereichen in der obigen Anmerkung zu erkennen. Identifizieren Sie die vorherrschende Morphologie pro Standort: Neuronale zytoplasmatische Einschlüsse (NCIs), Distrophische Neuriteneinschlüsse (DNs), Nukleare Einschlüsse (NIIs). Definieren Sie das Muster: A (vorherrschende NN und DNs: bvFTD und nfPPA); B (vorherrschende NSI: FTD-MND); C (überwiegend lange DNs: svPPA und bvFTD)51,64. Verwenden Sie Nelsons Schema, um das Vorhandensein von TDP-43 in AD-Fällen65,66zu definieren. Bewerten Sie den Hippocampus ausgehend von Subiculum und Sommer (CA1). Verwenden Sie die Punktzahl der Rauramaa (0:4): 1-2 für Mikroinfarkte bzw. Makroinfarkte; 3–4 entspricht einem mittelschweren bzw. schweren neuronalen Verlust bzw. Hippocampus-Atrophie (Hippocampussklerose: HS). Weisen Sie auf das Vorhandensein oder Fehlen pathologischer Proteinablagerungen hin (in abnehmender Reihenfolge67der Häufigkeit: pTAU, TDP-43, Definieren Sie die neuropathologische Diagnose und geben Sie alle pathologischen Daten in die Datenbank ein.HINWEIS: Die Räume, in denen das biologische Material und die sensiblen Daten der Spender gespeichert sind, sind immer verschlossen und nur das autorisierte Personal darf betreten werden, um sowohl Sicherheit als auch Privatsphäre zu gewährleisten. Das gefrorene biologische Material wird in verschlossenen Gefriertruhen bei -80 °C gelagert, während formalinfixierte Paraffin-eingebettete Gewebe in verschlossenen Schränken bei Raumtemperatur gelagert werden. Es werden Zweimotor-Gefrierschränke verwendet und ein Back-up-Gefrierschrank ist ebenfalls vorhanden. Um sicherzustellen, dass die Gefriertruhen immer funktionieren, verfügen sie über ein 24/7-Überwachungssystem, das einen Alarm auslöst. Bei Stromausfall ist auch ein Notstromaggregat vorhanden. Die Teilnehmer werden mit einem numerischen Code anonymisiert, um ihre Privatsphäre zu gewährleisten; es ist nicht möglich, dass nicht autorisiertes Personal zur Identität der Spender und ihrer sensiblen Daten zurückkehrt. Alle Informationen werden in einer kennwortgeschützten Datenbank gesammelt. ebenso wird eine Gedruckte dieser Daten in gesperrten Archiven aufbewahrt.