Summary

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.

Abstract

Die Isolierung von Mikrogefäßen aus dem Zentralnervensystem (ZNS) wird häufig durch die Kombination von kortikalem Gewebe von mehreren Tieren, meist Nagetieren, durchgeführt. Dieser Ansatz begrenzt die Abfrage von Eigenschaften der Blut- und Hirnschranke (BBB) auf den Kortex und lässt keinen individuellen Vergleich zu. Dieses Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer Isolationsmethode, die den Vergleich der neurovaskulären Einheit (NVU) aus mehreren ZNS-Regionen ermöglicht: Kortex, Kleinhirn, Optiklappen, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll, das ursprünglich für murine Proben entwickelt wurde, erfolgreich für den Einsatz an ZNS-Geweben kleiner und großer Wirbeltierarten angepasst, von denen wir auch Mikrogefäße aus weißer Materie der Gehirnhälfte isolieren können. Diese Methode, in Kombination mit Immunolabeling, ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression und einen statistischen Vergleich zwischen Individuen, Gewebetyp oder Behandlung. Wir haben diese Anwendbarkeit bewiesen, indem wir Veränderungen der Proteinexpression während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), einem murinen Modell einer neuroinflammatorischen Erkrankung, Multipler Sklerose, bewertethaben. Zusätzlich könnten Mikrogefäße, die mit dieser Methode isoliert werden, unter anderem für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot eingesetzt werden. Auch wenn dies nicht der erste Versuch ist, ZNS-Mikrogefäße ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder enzymatischer Dissoziation zu isolieren, ist es in seiner Fähigkeit für den Vergleich einzelner Individuen und mehrerer ZNS-Regionen einzigartig. Daher ermöglicht es die Untersuchung einer Reihe von Unterschieden, die sonst unklar bleiben können: ZNS-Teile (Cortex, Kleinhirn, optischer Lappen, Hirnstamm, Hypothalamus, Hypophyse und Rückenmark), ZNS-Gewebetyp (graue oder weiße Materie), Personen, experimentellen Behandlungsgruppen und Arten.

Introduction

Unser Gehirn ist das wichtigste Organ in unserem Körper. Aus diesem Grund ist es eine Priorität, die Homöostase des Gehirns trotz externer Faktoren zu halten, die eine Abweichung von der Normalität auslösen können. Einigen Gelehrten zufolge entwickelten Wirbeltierevoretwa 400 bis 500 Millionen Jahren das, was wir heute als Blut-Hirn-Schranke (BBB)2,3bezeichnen. Dieser schützende “Zaun” übt den größten Einfluss auf die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aus und wirkt, indem er den Transport von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen Blut und ZNS-Parenchym streng reguliert. Wenn die BBB gestört ist, wird das Gehirn anfällig für toxische Exposition, Infektion, und Entzündungen. Daher, BBB Dysfunktion ist verbunden mit vielen, wenn nicht alle, neurologische und neuroentwicklungsbedingten Störungen4,5,6.

Die ausgeklügelte Funktion des BBB wird der einzigartigen ZNS-Mikrovaskulatur zugeschrieben, die von der neurovaskulären Einheit (NVU)2,3angepasst wird. Hochspezialisierte Endothelzellen, Pericyten und astrozytäre Endfüße sind die zellulären Komponenten der NVU2,3. Die von diesen Zellen erzeugte extrazelluläre Matrix ist auch für die NVU- und BBB-Physiologie2,3von wesentlicher Bedeutung. Obwohl wesentliche zelluläre und molekulare Komponenten der NVU unter Wirbeltieren konserviert werden, wird Heterogenität zwischen Ordnungen und Arten7,8berichtet. Technische Einschränkungen behindern jedoch unsere Fähigkeit, diese Unterschiede in der Neurobiologie, Biomedizin oder translationalen Forschung vollständig zu berücksichtigen.

Aus diesem Grund haben wir eine CNS-regionsspezifische Mikrogefäß-Isolationsmethode erweitert, um sie auf zahlreiche Arten aus allen fünf Wirbeltiergruppen anzuwenden: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Das Protokoll wird für die Anwendung an klein-lissenzephalischen und großkreiselzephalen Wirbeltieren beschrieben, einschließlich Arten mit translationaler Relevanz9. Darüber hinaus schließen wir andere Regionen des ZNS ein, die in diesem Zusammenhang noch nicht untersucht wurden, aber für die Neurophysiologie relevant sind und enorme klinische Auswirkungen haben: Hypothalamus, Hypophyse und weiße Materie. Schließlich haben wir die Fähigkeit dieser Isolationsmethode als zuverlässiges Werkzeug getestet, um Veränderungen der Proteinexpression entlang der NVU und/oder BBB9,10,11zu identifizieren. Als Proof-of-Concept haben wir gezeigt, wie Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression während der EAE mithilfe der Isolationsmethode gefolgt von Immunfluoreszenz bestimmt werden können.

Protocol

Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien der University of California (UC), davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Die Tierpflege an der UC Davis wird durch mehrere unabhängige Ressourcen reguliert und ist seit 1966 von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert. Porcine CNS Gewebe wurden von UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory gewonnen. ZNS-Gewebe aus Rhesus-Makaken wurden vom C…

Representative Results

Mikrogefäße, die aus muriner ZNS isoliert wurden, zeigten alle intrinsischen zellulären Komponenten der neurovaskulären Einheit2,3. Verwendung von Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 (PECAM, auch bekannt als CD31) oder Isolectin IB4 (ein Glykoprotein, das die Endothelzelle Glycocalyx bindet) für Endothelzellen, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGFR) oder neuron-gliales Antigen 2 (NG2) für Pericyte und Aq…

Discussion

Die BBB enthält die einzigartigen Eigenschaften der Gehirn Mikrovaskulatur Endothelzellen gekoppelt durch eine anspruchsvolle Architektur von engen-, Adheren-, “Peg-Socket”-Kreuzungen und Haftungs-Plaques kritisch für ZNS-Homöostase2,3,19. Endothelzellen Eigenschaften werden induziert und gepflegt durch Pericyten und die umgebenden Astroglia Endfußprozesse2,3,</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Cruz-Orengo wurde von der University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds unterstützt.

Materials

10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

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Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

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