Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.
Abstract
Die Isolierung von Mikrogefäßen aus dem Zentralnervensystem (ZNS) wird häufig durch die Kombination von kortikalem Gewebe von mehreren Tieren, meist Nagetieren, durchgeführt. Dieser Ansatz begrenzt die Abfrage von Eigenschaften der Blut- und Hirnschranke (BBB) auf den Kortex und lässt keinen individuellen Vergleich zu. Dieses Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer Isolationsmethode, die den Vergleich der neurovaskulären Einheit (NVU) aus mehreren ZNS-Regionen ermöglicht: Kortex, Kleinhirn, Optiklappen, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll, das ursprünglich für murine Proben entwickelt wurde, erfolgreich für den Einsatz an ZNS-Geweben kleiner und großer Wirbeltierarten angepasst, von denen wir auch Mikrogefäße aus weißer Materie der Gehirnhälfte isolieren können. Diese Methode, in Kombination mit Immunolabeling, ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression und einen statistischen Vergleich zwischen Individuen, Gewebetyp oder Behandlung. Wir haben diese Anwendbarkeit bewiesen, indem wir Veränderungen der Proteinexpression während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), einem murinen Modell einer neuroinflammatorischen Erkrankung, Multipler Sklerose, bewertethaben. Zusätzlich könnten Mikrogefäße, die mit dieser Methode isoliert werden, unter anderem für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot eingesetzt werden. Auch wenn dies nicht der erste Versuch ist, ZNS-Mikrogefäße ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder enzymatischer Dissoziation zu isolieren, ist es in seiner Fähigkeit für den Vergleich einzelner Individuen und mehrerer ZNS-Regionen einzigartig. Daher ermöglicht es die Untersuchung einer Reihe von Unterschieden, die sonst unklar bleiben können: ZNS-Teile (Cortex, Kleinhirn, optischer Lappen, Hirnstamm, Hypothalamus, Hypophyse und Rückenmark), ZNS-Gewebetyp (graue oder weiße Materie), Personen, experimentellen Behandlungsgruppen und Arten.
Introduction
Unser Gehirn ist das wichtigste Organ in unserem Körper. Aus diesem Grund ist es eine Priorität, die Homöostase des Gehirns trotz externer Faktoren zu halten, die eine Abweichung von der Normalität auslösen können. Einigen Gelehrten zufolge entwickelten Wirbeltierevoretwa 400 bis 500 Millionen Jahren das, was wir heute als Blut-Hirn-Schranke (BBB)2,3bezeichnen. Dieser schützende “Zaun” übt den größten Einfluss auf die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aus und wirkt, indem er den Transport von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen Blut und ZNS-Parenchym streng reguliert. Wenn die BBB gestört ist, wird das Gehirn anfällig für toxische Exposition, Infektion, und Entzündungen. Daher, BBB Dysfunktion ist verbunden mit vielen, wenn nicht alle, neurologische und neuroentwicklungsbedingten Störungen4,5,6.
Die ausgeklügelte Funktion des BBB wird der einzigartigen ZNS-Mikrovaskulatur zugeschrieben, die von der neurovaskulären Einheit (NVU)2,3angepasst wird. Hochspezialisierte Endothelzellen, Pericyten und astrozytäre Endfüße sind die zellulären Komponenten der NVU2,3. Die von diesen Zellen erzeugte extrazelluläre Matrix ist auch für die NVU- und BBB-Physiologie2,3von wesentlicher Bedeutung. Obwohl wesentliche zelluläre und molekulare Komponenten der NVU unter Wirbeltieren konserviert werden, wird Heterogenität zwischen Ordnungen und Arten7,8berichtet. Technische Einschränkungen behindern jedoch unsere Fähigkeit, diese Unterschiede in der Neurobiologie, Biomedizin oder translationalen Forschung vollständig zu berücksichtigen.
Aus diesem Grund haben wir eine CNS-regionsspezifische Mikrogefäß-Isolationsmethode erweitert, um sie auf zahlreiche Arten aus allen fünf Wirbeltiergruppen anzuwenden: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Das Protokoll wird für die Anwendung an klein-lissenzephalischen und großkreiselzephalen Wirbeltieren beschrieben, einschließlich Arten mit translationaler Relevanz9. Darüber hinaus schließen wir andere Regionen des ZNS ein, die in diesem Zusammenhang noch nicht untersucht wurden, aber für die Neurophysiologie relevant sind und enorme klinische Auswirkungen haben: Hypothalamus, Hypophyse und weiße Materie. Schließlich haben wir die Fähigkeit dieser Isolationsmethode als zuverlässiges Werkzeug getestet, um Veränderungen der Proteinexpression entlang der NVU und/oder BBB9,10,11zu identifizieren. Als Proof-of-Concept haben wir gezeigt, wie Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression während der EAE mithilfe der Isolationsmethode gefolgt von Immunfluoreszenz bestimmt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die BBB enthält die einzigartigen Eigenschaften der Gehirn Mikrovaskulatur Endothelzellen gekoppelt durch eine anspruchsvolle Architektur von engen-, Adheren-, “Peg-Socket”-Kreuzungen und Haftungs-Plaques kritisch für ZNS-Homöostase2,3,19. Endothelzellen Eigenschaften werden induziert und gepflegt durch Pericyten und die umgebenden Astroglia Endfußprozesse2,3,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Cruz-Orengo wurde von der University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds unterstützt.
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
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