عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الاوعيه المجهرية من مناطق متعددة من الجهاز العصبي المركزي لفقاريات السسينسيفريك والفقريات.
Abstract
يتم اجراء عزل الاوعيه الدقيقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) عاده عن طريق الجمع بين الانسجه القشرية من العديد من الكائنات ، وغالبا ما تكون القوارض. هذا النهج يحد من التحقيق في خصائص حاجز الدم في الدماغ (BBB) إلى القشرة ولا يسمح للمقارنة الفردية. يركز هذا المشروع علي تطوير طريقه العزلة التي تسمح للمقارنة بين وحده الاوعيه الدموية (NVU) من المناطق العصبية المتعددة: القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، المهاد ، الغدة النخامية ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي. وعلاوة علي ذلك ، تم تكييف هذا البروتوكول ، الذي وضع أصلا لعينات murine ، بنجاح للاستخدام علي الانسجه العصبية من الأنواع الصغيرة والكبيرة فقاري التي نحن أيضا قادره علي عزل الاوعيه الدقيقة من المادة البيضاء في نصف الكره الدماغ. هذا الأسلوب ، عندما يقترن مع المناعي ، يسمح لكميه من التعبير البروتين والمقارنة الاحصائيه بين الافراد ، ونوع الانسجه ، أو العلاج. وقد أثبتنا هذا التطبيق من خلال تقييم التغيرات في تعبير البروتين خلال التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، وهو نموذج murine للمرض التهابي العصبي ، والتصلب المتعدد. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الاوعيه المجهرية المعزولة بواسطة هذه الطريقة للتطبيقات المصب مثل qPCR ، الحمض الريبي المتسلسل ، ولطخه الغربية ، من بين أمور أخرى. علي الرغم من ان هذه ليست المحاولة الاولي لعزل الاوعيه الدقيقة CNS دون استخدام الانحلال القصبي أو التفكك الانزيمي ، فهي فريدة من نوعها في الدقة للمقارنة بين افراد واحد والمناطق العصبية المتعددة. لذلك ، فانه يسمح للتحقيق في مجموعه من الاختلافات التي قد تظل غامضه والا: أجزاء CNS (القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، جذع الدماغ ، المهاد ، الغدة النخامية ، والحبل الشوكي) ، ونوع الانسجه العصبية (المادة الرمادية أو البيضاء) ، والافراد ، مجموعات العلاج التجريبية ، والأنواع.
Introduction
دماغنا هو الجهاز الأكثر اهميه في جسمنا. لهذا السبب, الحفاظ علي التوازن الدماغ علي الرغم من العوامل الخارجية التي قد تؤدي إلى انحراف عن الحياة الطبيعية هو اولويه. وفقا لبعض العلماء ، حوالي 400-500 مليون سنه مضت1، فقاري الحيوانية وضعت ما نعرفه الآن باسم حاجز الدم في الدماغ (BBB)2،3. هذا “السياج” الواقية تمارس أكبر قدر من التاثير علي النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن والوظائف من خلال تنظيم باحكام نقل الأيونات والجزيئات والخلايا بين الدم والخلية العصبية. عندما تتعطل BBB ، يصبح الدماغ عرضه للتعرض السام ، والعدوى ، والتهاب. ولذلك ، يرتبط الخلل الوظيفي BBB مع العديد ، ان لم يكن كل ، اضطرابات العصبية والنمو العصبي4،5،6.
وتعزي الوظيفة المتطورة لل BBB إلى الاوعيه المجهرية العصبية الفريدة التي تتوافق مع وحده الاوعيه العصبية (nvu)2،3. الخلايا البطانية عاليه التخصص ، بيريسيلات ، والقدمين النهاية استروسيتيك هي المكونات الخلوية لل nvu2،3. مصفوفة خارج الخلية المتولدة من هذه الخلايا هي أيضا ضرورية لل nvu و BBB فسيولوجيا2,3. علي الرغم من ان المكونات الخلوية والجزيئية الاساسيه لل nvu يتم الحفاظ عليها بين الفقاريات ، يتم الإبلاغ عن عدم التجانس بين الأوامر والأنواع7،8. ومع ذلك ، القيود التقنية تعيق قدرتنا علي النظر بشكل كامل في هذه الاختلافات في البيولوجيا العصبية ، الطب الحيوي ، أو البحوث الانتقالية.
وبسبب ذلك ، قمنا بتوسيع طريقه العزل المجهري الخاصة بمنطقه السفينة العصبية الخاصة لجعلها قابله للتطبيق علي العديد من الأنواع من مجموعات الفقاري الخمسة: الأسماك والبرمائيات والزواحف والطيور والثدييات. يوصف البروتوكول لاستخدامه علي الفقاريات الصغيرة والفقريات الكبيرة ، بما في ذلك الأنواع ذات الصلة الانتقالية9. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن تشمل مناطق أخرى من الCNS لم يتم التحقيق فيها من قبل في هذا السياق ، ولكن ذات الصلة لفسيولوجيا الأعصاب ومع الآثار السريرية الهائلة: المهاد ، الغدة النخامية ، والمادة البيضاء. وأخيرا ، اختبرنا قدره هذه الطريقة العزلة كاداه موثوق بها لتحديد التغيرات في تعبير البروتين علي طول nvu و/أو BBB9،10،11. كدليل علي المفهوم ، أظهرنا كيفيه تحديد التغييرات في VCAM-1 والتعبير جام-B خلال EAE باستخدام طريقه العزل تليها المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن BBB الخصائص الفريدة للخلايا الغشائية الوعائية المجهرية التي يقترن بها بنيه متطورة من ضيق-، ملتصقين-، “ربط المقبس”-تقاطعات ، والتصاق لويحات الحرجة ل CNS التوازن2،3،19. يتم الحث علي خصائص الخلايا البطانية والحفاظ عليها من قبل pericytes والعمل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الدكتور كروز اورينجو من قبل جامعه كاليفورنيا ، ديفيس ، كليه الطب البيطري بدء الأموال.
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
- O’Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
