Un compito per valutare l'impatto di un partner sulla velocità e l'accuratezza delle prestazioni motorie nei ratti

Questo protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato di Esperimento Animale di Doshisha. NOT:</ Condurre tutte le sessioni sperimentali durante il periodo di luce. 1. Animali Utilizzare 15 ratti albini maschi ingenui sperimentalmente che pesano 300-350 g. Li alloggiano in gabbie individuali di un locale di riproduzione controllato con la temperatura e l’umidità appropriate (23 x 2 gradi centigradi, 70%) e l’accesso al libitum ad all’acqua. Mantenere il ciclo di luce/scuro a 12 h/12 h (il periodo di luce inizia alle 8:00 AM). Assegna 10 ratti come soggetti, e il resto come ratti confederati usando la randomizzazione. Mantenere i pesi dei ratti all’85-90% dei loro pesi liberi durante l’esperimento per privazione alimentare. NOT:</ L’assegnazione di confederati è quella di ridurre il numero di animali necessari e il tempo per uno studio. 2. Apparatus NOT:</ La panoramica dell’apparato è illustrata nella Figura 1. L’apparecchio è stato sviluppato e modificato in riferimento agli studi precedenti16,17. Costruire una scatola acrilica trasparente (19 cm x 110 cm x 20 cm) con una partizione centrale (5 cm di larghezza) e inserire due porte a ghigliottina. Posizionare le porte ghigliottina a 15 cm di distanza da ogni estremità della scatola. Montare un cicalino (400 Hz, 75 dB) sul divisorio e montare un dispenser di pellet per servire un pellet di ricompensa (45 mg) in un recipiente alimentare sul lato del soggetto della scatola. Impostare una leva metallica (barra di presa: 3 mm, 5 cm di altezza) su uno scaffale all’interno della partizione centrale, che ha una fessura (1,5 cm di larghezza) su ogni parete rivolta verso la pista (Figura 2), al fine di consentire al ratto soggetto di accedere alla leva utilizzando gli arti anteriori. Sul lato confederato, tuttavia, inserire un muro trasparente di fronte al muro della partizione che vieta al confederato di accedere alla leva. Posizionare un interruttore per attivare l’erogatore sotto la leva che viene premuto dal movimento a leva dei ratti. Legare la giusta lunghezza dell’intestino alla leva, che è necessaria per lo sperimentatore per tirare su la leva. Utilizzare Arduino Mega 2560 REV3 per controllare le porte della ghigliottina, il buzzer e il dispenser a pellet e per ottenere il valore dai sensori a infrarossi e dall’interruttore del dispenser. Preparare un compressore d’aria (25 L) per azionare il cilindro dell’aria e aprire la porta della ghigliottina. Posizionare una videocamera vicino alla partizione dell’esterno dell’apparecchio, al fine di registrare le prestazioni di leva-pull dei ratti da una vista laterale (60 fotogrammi al secondo [fps]). Utilizzare un software di riproduzione video adeguato per eseguire l’analisi fotogramma per fotogramma della registrazione video. Figura 1: Uno schema dell’apparato utilizzato in questo protocollo. Una partizione centrale divide la casella in due campi. C’è una porta ghigliottina su ogni lato della scatola, e la porta divide il campo nella zona di partenza e pista. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: La partizione centrale dell’apparecchio. I ratti possono afferrare una barra e tirare la leva attraverso una sacca della partizione. Un interruttore dell’erogatore di pellet è impostato sotto la leva, e un’azione di trazione a leva si traduce in una consegna a pellet. Questa cifra è stata modificata da Sekiguchi e Hata12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Procedura Manipolazione e assuefazione per i pellet di ricompensa Prima delle procedure di allenamento, maneggiare tutti i ratti per 10 min/giorno per 3 giorni dallo sperimentatore. Come assuefazione per i pellet di ricompensa, dare ad ogni ratto 3 g di pellet di ricompensa per 3 giorni dopo la manipolazione. L’abitudine all’apparato Ratti soggetti Il terzo giorno di assuefazione per i pellet di ricompensa, prima che lo sperimentatore doni pellet giornalieri, mette ogni ratto nella pista del lato del soggetto dell’apparato per 15 min per l’assuefazione, con la porta ghigliottina chiusa. Ratti confederati NOT:</ Ci sono due sessioni di assuefazione. Alla prima abitudine, posizionare ogni ratto sulla pista del lato confederato dell’apparato per 15 min durante lo stesso periodo del passo 3.2.1.1. Alla seconda abitudine, seguire il metodo nel passaggio 3.2.2.1 del giorno dopo che i ratti soggetti hanno completato l’allenamento per la sequenza run-and-pull (come indicato nella sezione 3.6).NOTA: Condurre sessioni di assuefazione per ratti confederati e ratti soggetti separatamente, cioè un ratto alla volta. Non lasciare che un topo incontri un altro ratto nell’apparato fino all’inizio della fase di prova. Formazione su riviste NOT:</ Per i ratti soggetti, condurre una sessione di formazione rivista il giorno successivo dell’assuefazione all’apparato come segue. Se i ratti non mangiano tutti i pellet di cibo, quindi conduci di nuovo la sessione di allenamento della rivista il giorno successivo. Mettete un pellet premio sul recipiente alimentare da parte dei confederati per escludere l’effetto della proprietà olfattiva del pellet, che il confederato mangia nella fase di prova (riferimento alla sezione 3.7). Posizionare un ratto soggetto sulla pista del lato del soggetto, con la porta ghigliottina chiusa. Consegnare un pellet premio nel recipiente alimentare 60 volte utilizzando il dispenser di pellet in un tempo variabile 30-s programma. Assicurarsi che il ratto soggetto mangi tutti i pellet consegnati. Shaping per l’azione leva-pullNOTA: la figura 3 è un diagramma di flusso dell’esperimento. Metti un pellet premio sul recipiente alimentare sul lato e sul lato confederato di ogni soggetto. Non posizionare il ratto confederato nelle sessioni di plasmare. Posizionare il ratto soggetto sulla pista del lato del soggetto con la porta ghigliottina chiusa. Poi addestrare i ratti per tirare giù la leva. Modella gradualmente il comportamento della leva-tiro seguendo cinque criteri di rinforzo (A-E): (A) Avvicinati alla scissione. (B) Toccare la barra di presa sul muso o sull’anteriore del topo, con la leva precedentemente tirata verso il basso al lato del soggetto. (C) Toccare la barra di presa, con la leva inclinata verso il lato del ratto (con un angolo di 60 gradi centigradi). (D) Afferrare e tirare verso il basso la barra al lato del ratto utilizzando la stessa condizione del criterio C. (E) Afferrare e tirare verso il basso la barra al lato del ratto con la leva in piedi in posizione verticale. Termina le sessioni giornaliere quando vengono assegnate 60 ricompense o sono trascorsi 30 minuti. Quando un ratto completa il criterio E 40 volte in una sessione, la fase di modellazione della leva-tiro è terminata in quel giorno. NOT:</ Quasi tutti i ratti terminano la sessione di modellamento giornaliera entro 20 min. Figura 3: Un diagramma di flusso della procedura sperimentale. I ratti soggetti passano attraverso le fasi di allenamento e le fasi di test in questo ordine. Questa cifra è stata modificata da Sekiguchi e Hata12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Formazione per l’azione leva-pull Posizionare il ratto soggetto nell’area di partenza. Non mettere il ratto confederato nelle sessioni di allenamento. Presentare il tono del cicalino per 5 s, quindi aprire la porta. Quando il ratto soggetto tira giù la leva, consegnare un pellet di cibo e tirare la leva utilizzando un intestino legato alla leva. Dopo che i ratti abbassano la leva per 10 volte (primi 3 giorni della fase) o 6 volte (ultimi 3 giorni della fase) e consumano tutti i pellet di ricompensa, chiudi la porta e spostali nell’area di partenza per mano dello sperimentatore. Dopo un intervallo di interprove (ITI) di 20 s, ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2. Termina le sessioni giornaliere quando ogni ratto ha guadagnato 60 pellet. NOT:</ Questo addestramento mira anche ad abituare i ratti al tono del cicalino e all’apertura della porta perché i ratti Wistar normalmente mostrano un comportamento di congelamento in un primo momento in risposta al movimento della porta. Una sessione giornaliera per ogni ratto richiede circa 15 min. Sono necessari sei giorni per questa fase di allenamento. Fase di allenamento per la sequenza run-and-pull Eseguire la stessa procedura nel passaggio 3.5.1. Quando i ratti tirano giù la leva una volta e consumano un pellet di ricompensa, chiudi la porta e spostali verso l’area di partenza per mano dello sperimentatore. Dopo un’ITI di 20 s, iniziare la prova successiva (passaggi 3.6.1 e 3.6.2). Termina la sessione giornaliera quando ogni ratto ha guadagnato 30 pellet. NOT:</ Una sessione giornaliera per ogni ratto richiede circa 20 min. Sono necessari circa 10 giorni per raggiungere i punteggi dei ratti. Fasi di test Figura 4: Descrizione di ogni condizione di test. In singole fasi, il ratto soggetto ha eseguito il compito solitariamente. Nelle fasi di coppia, posizionare il ratto confederato in pista sul lato opposto al ratto soggetto. Un muro trasparente di fronte alla partizione impedisce al ratto confederato di accedere alla leva. Questa cifra è stata modificata da Sekiguchi e Hata12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. NOT:</ Le fasi di test includono sessioni in due condizioni, singola o coppia (Figura 4). Nella singola condizione, i ratti eseguono il compito in modo solitario; vale a dire, le prove sono identiche alla sessione di formazione per la sequenza run-and-pull (sezione 3.6). Nella condizione di coppia, il ratto confederato è presente sul lato opposto della scatola. Il ratto confederato non può accedere alla leva a causa della chiara parete acrilica di fronte alla partizione. Condurre una singola sessione identica alle sessioni nella fase di allenamento per la sequenza run-and-pull (sezione 3.6). Termina la sessione giornaliera quando ogni ratto ha guadagnato 30 pellet. Metti un pellet premio sul recipiente alimentare dalla parte del confederato, specialmente durante le sessioni in una sola condizione. Nelle sessioni di coppia, dare al ratto confederato un pellet ricompensa durante l’ITI del ratto soggetto al fine di mantenere il ratto confederato vicino alla partizione. 4. Analisi dei dati Indice di precisione delle prestazioniIndex of performance accuracy Registrare i video del movimento della leva-tiro dei ratti utilizzando la videocamera vicino alla partizione dell’esterno dell’apparato. Una volta completate tutte le sessioni, confermare la valutazione mediante l’analisi fotogramma per fotogramma delle registrazioni video utilizzando un adeguato software di riproduzione video. Valutare se il movimento di trazione del ratto di una prova è stato il primo colpo o meno dall’osservazione visiva dello sperimentatore durante l’esperimento. NOT:</ La prova di primo colpo è definita come la prova in cui i ratti potrebbero afferrare e tirare giù la leva durante il loro primo tentativo di leva. Calcolare i tassi di primo colpo per ogni soggetto come la proporzione di prove di primo colpo a tutte le prove in ogni sessione (per la fase di allenamento run-and-pull) o in ogni fase (per le fasi di test) da utilizzare nell’analisi. Indici di velocità di esecuzione Calcolare il tempo necessario per completare una prova dal valore dell’interruttore del dispenser di pellet: il tempo necessario per completare una prova – (il momento in cui viene premuto l’interruttore) – (il momento in cui la porta è aperta). Quindi dividere il tempo necessario per il completamento di una prova in tre sezioni utilizzando i valori dei sensori a infrarossi (Figura 5). NOT:</ La latenza di avvio (Figura 5a) è definita come il tempo che va dall’apertura della porta all’arrivo del ratto al primo sensore. Analogamente, il tempo di esecuzione (Figura 5b) è il tempo che va dall’arrivo al primo sensore all’arrivo al secondo sensore. La latenza di trazione delle leva (Figura 5c) è il tempo che intervada dal secondo sensore al punto temporale in cui viene premuto l’interruttore del distributore. Utilizzare solo le durate delle prove di primo successo per l’analisi. Calcolare i valori mediani di ogni soggetto per ogni sessione (delle sessioni di formazione) e ogni fase (delle fasi di test) per l’analisi. Figura 5: Misurazione degli indici di velocità di esecuzione. (a) Latenza di inizio: la durata dall’apertura della porta all’arrivo del ratto al primo sensore. (b) Tempo di esecuzione: la durata dall’arrivo del ratto al primo sensore al suo arrivo al secondo sensore. (c) Latenza leva:pull: la durata dall’arrivo del ratto al secondo sensore al completamento di una risposta leva-pull. Questa cifra è stata modificata da Sekiguchi e Hata12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Analisi statistica Per gli indici nella fase di training della sequenza run-and-pull, eseguire l’analisi unidirezionale a misura ripetuta della varianza (ANOVA) con il numero di sessioni come fattore all’interno dell’argomento per ogni indice. Per gli indici nella fase di test, condurre ANOVA a misura ripetuta bidirezionale con il numero della fase (fase 1 o 2) e della condizione (coppia o singola) come fattori all’interno dell’argomento per ogni indice nelle fasi di test. La rilevanza statistica è stata impostata a 0,05 USD.