マウスをマラセチアに感染させ、真菌-宿主相互作用を研究する

このプロトコルに記載されているすべての手順は、環境連邦事務所(www.bafu.admin.ch)の封じ込められたシステムにおける生物の取り扱いに関する条例に従って行われた。マウス実験は、スイス動物保護法のガイドラインに従って厳格に行われ、スイスのチューリッヒ州の獣医局によって承認されたプロトコルの下で行われました(ライセンス番号168/2018)。 1. 実験室条件下でのマラセチアの栽培 注:このプロトコルに使用されるすべての試薬と媒体は、特に明記されていない限り、真菌の増殖を阻害する可能性がありますので、室温(RT、20〜25°C)で保管してください。 マラセチア成長のために液体修飾ディクソン(mDixon)培地を準備する。500mLの液体mDixon培地を調製するには、18gモルトエキス、乾燥オックス胆汁、5mL Tween-40、3 gペプトン、1 mLグリセロールおよび1mLオレイン酸を500mL蒸留H2O(dH2O)で溶解する。HClとオートクレーブを使用して、培地をpH6に調整します。メディアを RT に保存します。 オートクレーブ処理の前に500 mL mDixon培地に7.5gの寒天を加えてmDixon寒天プレートを準備します。ステアリングバーと磁気加熱プレートを使用してオートクレーブした後、mDixon寒天をゆっくりと冷却し、冷却中に媒体の部分的な固化を避けます。 寒天が50〜60°Cに冷却されたら、層流フードでペトリ皿に液体を分配し、一晩RTで乾燥させます。注:寒天プレートは、蒸発を避けるために巻き付け、逆さまに保つ場合、4°Cで数週間保存することができます。 プロバイダーが入手した指示に従って、マラセチアの単離物を分離し、凍結乾燥したストックを復活させる。 10 mL の液体 mDixon 培地を無菌 100 mL エルレンマイヤーフラスコに接種し、プロバイダーが入手した指示に従って復活したマラセチア懸濁液を使用します。30°Cおよび180rpmで振とうインキュベーターで培養をインキュベートする。 クリーム色と濁度の出現をチェックして、マラセチア文化の成長を定期的に検査します。成長動態は、マラセチアの種と株に依存し、マラセチアが凍結乾燥したストックから新たに復活すると特に遅くなることがある。(図 1A)。 mDixon培地で密に成長したマラセチア培養物の3部を無菌99%グリセロールの1部と混合してグリセロールストックを調製する。アリコートマラセチア/グリセロール混合物を滅菌スクリューキャップチューブに入れ、-80°Cで保管する。 インビトロ伝播の場合、mDixonの液体培養物から、または凍結したグリセロールストックから、接種ループを使用してmDixon寒天プレート(4°からRTに持ち込まれる)にマラセチアをプレートします。注:冷たいmDixon寒天培地は真菌の成長を阻害するので、使用前に4°CからRTにmDixon寒天プレートを転送します。 30°Cの(非揺れ)インキュベーターで、マラセチアを逆さまにして寒天プレートをインキュベートします。マラセチアコロニーの成長を定期的に検査します。注:mDixon寒天プレート上のマラセチアコロニーは3〜5日以内に現れ、クリーム色の鈍く、凸型の標高で滑らかです(図1B)。 マラセチアのコロニーをrtの寒天プレートに2週間保存します。その後、1.7に記載されているように冷凍グリセロールストックからマラセチアをストリークして新しいmDixon寒天板を調製する。 2. マウスの実験的なマラセチア感染に対する接種の調製 mDixon寒天プレートから3〜5個の個々のマラセチアコロニーを有する無菌100mLエルレンマイヤーフラスコ中の液体mDixon培地の10mLを接種する(ステップ1、図1B参照)。 マラセチア培養物を30°Cで~48~96時間、180rpmで培養物がクリーム色と濁り(図1A)にインキュベートする(図1A)。注:マラセチアの成長に必要な時間は、マラセチアの種と株と接種に使用される真菌の量に依存します。 マラセチア培養物の2mLを無菌2mLマイクロ遠心管に移し、遠心分離機を10,000xgで1分間移動する。 上清を廃棄し、リン酸緩衝塩溶液(PBS)を1mLにかみつけてペレットを洗浄する。10,000 x gで 1 分間再び遠心分離機 . 洗浄後、激しいピペットにより1mLのPBSにペレットを一時停止し、分光計を用いて600nm(ODA600)で溶液の光学密度を測定する。OD測定用のPBSでマラセチア懸濁液20~50倍を希釈し、読み取り値が0.1~1であることを保証します。注:マラセチアの3日間培養の密度は、一般的に、マラセチアの種と菌株、および培養の接種に使用される酵母細胞の数に応じて、15~30 ODA600の間で変化します(ステップ2.1)。マラセチアは凝集体を形成する傾向があるので、懸濁液の均質性を確保するためには精力的なピペットが必要である。 アリコートは、4 ODA600の密度に相当するPBS中のマラセチア懸濁液の体積を滅菌2mLチューブに入れます。感染する動物1匹につき1本のチューブを用意する。 マラセチアを含むチューブを10,000 x gで1分間遠心分離する。 上清を廃棄し、天然オリーブオイル(2 ODA600酵母細胞/100°Lオリーブオイルに対応)の200°Lでマラセチアペレットを中断する。注:オリーブオイルは、マラセチアが親油性および脂質依存性酵母であるため、マラセチアとの上皮感染に適した手段であることが判明した。オリーブオイルはPBSよりも皮膚に吸収される方が良いです。しかし、オリーブオイルでマラセチアを中断することは容易ではないことに注意してください。ボルテックスによるマラセチア/オリーブオイル懸濁液を改善します。感染に使用されるまで、懸濁液はRTに保ちます。 コントロール動物の模擬感染のためにオリーブオイルだけでチューブを準備します。 3.マウスをマラセチアに感染させる 6-8週の年齢で雌C57BL/6マウスを注文し、少なくとも1週間の実験動物施設で順応することができます。感染していない対照群を含む、グループあたり3〜5匹のマウスを計算します。 PBSで1.3 mg/mLキシラジンおよび6.5 mg/mLケタミンを含む無菌麻酔カクテルを調製する。麻酔カクテルの5 mLは、20匹の動物を麻酔するのに十分です。麻酔する動物の数に応じてカクテルの音量を調整します。 腹腔内に麻酔カクテルの体重10μL/gを注入して動物を麻酔し(体重65mgケタミンと13mgキシラジン/体重に対応)、麻酔された動物を37°Cの加熱パッドに置きます。注:示された用量では、動物は通常~30〜60分間麻酔されたままである。 後足を鉗子でつまんで反射神経を確認し、動物が完全に麻酔されていることを確認します。 麻酔中の脱水症状を防ぐために、眼にアイクリームを塗ります。 必要に応じて、キャリパー(0~5mmの範囲)を使用して両耳の耳の厚さを測定します。各耳の2つの異なる領域を測定し、耳あたりの平均耳の厚さを計算します。メモ:耳の厚さを測定することはオプションであり、研究の質問に依存します。しかし、耳の厚さが皮膚炎症の読み出しとして使用される場合は、感染前にベースラインの耳の厚さを測定する必要があります。(ステップ 4 を参照)。 必要に応じて、軽度のテープストリッピングによって後耳皮膚の表皮バリアを破壊する:手動で皮膚に小さなテープを適用し、再びそれを取り除きます。各ラウンドに新鮮なテープを使用して、5回連続ラウンドに繰り返します。注:マラセチアは、不安定な皮膚と比較してバリア崩壊皮膚においてより顕著な皮膚炎症を誘発する(図2A)7. 無菌ピペットを使用して、マラセチア/オリーブオイル懸濁液の100°L(2 ODA600)を各耳の後ろ側に局所的に塗布します。オリーブオイルのみで処理される動物の対照群を含む(車両処理対照群)。注:ボルテックスマラセチア/オリーブオイル懸濁液は、アプリケーションの直前に均質なマラセチアサスペンションを確保するために精力的に。 麻酔をかけられた動物は、回復の兆候(ウィスカーの動き、呼吸数の増加など)を示すまで低体温を避けるために、加熱パッドに残します。 200 μL の無菌および予め温めた 2% グルコース溶液をニュータルフォールドに皮下に注入し、代謝と水分補給をサポートします。注:滅菌性2%グルコース溶液を調製するには、50mL PBSに1mgのグルコースを溶解し、0.2μmフィルタを使用して濾過します。溶液は4°Cで保存することができる。 動物をケージに戻します。 4.マラセチア誘発皮膚炎症の解析 注:この手順は、皮膚炎症のパラメータとして機能する感染中にマラセチア誘発耳腫脹の分析について説明する。真菌による耳の腫脹を分析するための前提条件は、テープ剥離および/または感染の前にベースラインの耳の厚さを測定することです(ステップ3.5)。 マラセチアの短期麻酔のためのアイソフルラン室を準備する – 感染し、動物を制御します。 一度に1匹ずつ室内に移動し、動物が完全に麻酔されるまで待ちます。注:適切な麻酔の徴候は、完全な身体のリラクゼーションだけでなく、遅くて重い(側面)呼吸を含みます。アイソフルランへの長時間暴露は致命的であり得るので、麻酔を注意深く監視する。 チャンバーから動物を取り出し、組織の上に置きます。 キャリパー(範囲0~5mm)を使用して耳の厚さを測定します。各耳の2つの異なる領域を測定し、耳あたりの平均厚さを計算します(ステップ3.5を参照)。 動物をケージに戻します。注:アイソフルラン麻酔は非常に短命であり、動物はアイソフルラン室から除去した後〜30s以内に回復します。 テープ剥離や感染の前に測定された平均ベースライン耳の厚さを、感染後の各時点で測定された平均耳の厚さから差し引くことによって、耳の厚さの増加を計算します。 計算された値を耳の厚さの増加としてプロットするか、または、代わりに、各動物または動物のグループの時間の経過に従って総耳の厚さとしてプロットする(図2B)。 5. 感染した皮膚における真菌負担の分析 収穫する各耳に滅菌2mLマイクロ遠心管を用意し、dH2Oに0.5mLの滅菌0.05%NP40とオートクレーブ鋼球(直径5mm)を含む。 精密バランスを使用してチューブを計量し、正確な重量を書き留めます。 CO2窒息によりマウスを安楽死させる。 ステップ5.1~5.2の説明に従って、ベースで耳を取り出し、0.5 mLの滅菌0.05%NP40を含むチューブにdH2Oで移します。 耳組織を含むチューブを計量し、臓器とチューブの重量から臓器のないチューブの重量を差し引くことによって、各サンプルの実際の重量を計算します。 組織ホモジナイザーを用いて25Hzで6分間耳組織を均質化する。組織が十分に均質化されていることを確認します。 各サンプルのプレート100μL(各ホモジネートの1/5に対応し、希釈係数=5)をmDixon寒天プレートに、30°Cのインキュベーターで逆さまにプレートをインキュベートする。注:ホモジネートめっきの量は、予想される真菌負荷に応じて調整する必要があります。容易な列挙を可能にするために、プレートあたり少なくとも10と250以上のコロニーを得るために十分なホモジネートをプレートしてください。必要に応じて、ホモジネートの異なる希釈を有するサンプルごとに複数のプレートをプレートする。 マラセチアコロニーの成長を定期的に検査します。注:コロニーは通常2-3日後に表示されます。マラセチア植民地が成長するために必要な時間は、マラセチアの種と株に依存します。 プレートごとにコロニーを数えます。 次の式を使用して、CFU/g 組織の数を計算します。CFU/g組織=(コロニー/プレート数)x(希釈係数)/(gにおける皮膚試料の重量)。注:おおよその最小検出限界は、次の式を使用して評価することができます:最小検出限界=(1コロニー/プレート)x(希釈係数)/(g内のすべての皮膚サンプルの平均重量)。 真菌荷重は通常、対数スケールでプロットされます(図2C)。