Infectar ratones con Malassezia spp. para estudiar la interacción hongo-huésped
Summary
Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón para estudiar malassezia-host interacciones en la piel. Describe el cultivo de Malassezia in vitro, la infección de la piel murina con Malassezia,y el análisis posterior de la inflamación y la carga fúngica en el tejido de la piel.
Abstract
Los modelos animales son cruciales para la investigación de enfermedades infecciosas. Proporcionan una base importante para analizar todo el espectro de interacciones que se producen entre los microbios y su huésped in vivo de una manera específica del tejido. Los hongos patógenos son cada vez más reconocidos como una seria amenaza para los seres humanos y la explotación de estos modelos de infección ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de la patogenicidad fúngica. Las especies del género Malassezia son los hongos más abundantes de la microbiota de la piel humana y también se asocian con el desarrollo de trastornos inflamatorios graves de la piel como la dermatitis seborreica y la dermatitis atópica. Sin embargo, se desconoce un vínculo causal entre Malassezia y la patogénesis de la enfermedad, un hecho que puede atribuirse al mal conocimiento de la compleja conversación cruzada de Malassezia con el sistema inmunitario de la piel. Este protocolo describe el establecimiento de un modelo experimental de ratón que permite estudiar la interacción de Malassezia con la piel de mamífero in vivo. Describe el método para el cultivo de Malassezia spp. en condiciones de laboratorio, cómo infectar la piel murina con Malassezia spp. y cómo evaluar el resultado de la infección mediante la inflamación de la piel y los análisis de carga de hongos. El modelo descrito aquí funciona en animales totalmente inmunocompetentes y no se basa en el pretratamiento inmunosupresor o antibiótico de los animales. Además, es adaptable a prácticamente todas las cepas de ratón modificadas genéticamente y se puede combinar con otros modelos de enfermedades de la piel. Estas características hacen de este modelo de infección una herramienta muy poderosa para estudiar en detalle la respuesta inmune innata y adaptativa del huésped contra Malassezia en la piel in vivo.
Introduction
La piel está poblada por muchos microbios diferentes. La exposición constante de la piel a la microbiota contribuye a dar forma y educar el sistema inmunológico del huésped. Los hongos son cada vez más reconocidos como una parte vital de la microbiota y cumplen un papel importante para la fisiología e inmunidad del huésped, similar a las bacterias y los virus1. Las especies del género Malassezia son con diferencia los hongos más abundantes colonizando la piel de los vertebrados de sangre caliente y conforman más del 90% del micobioma de la piel humana2,3. Dieciocho especies diferentes de Malassezia han sido identificadas hasta ahora a partir de la piel humana y animal4.
Se cree que surgen varias patologías de la piel, al menos parcialmente, como resultado de una composición de microbiota desequilibrada. La disbiosis puede conducir al crecimiento excesivo de especies con potencial patógeno que resulta en infecciones oportunistas y enfermedad5. Consistentemente, hay una creciente evidencia de que Malassezia,además de su estilo de vida commensal, contribuye al desarrollo de diversas patologías de la piel, que van desde la caspa y la pityriarsis versicolor a trastornos inflamatorios más graves como como dermatitis seborreica y dermatitis atópica4,6. Si bien se ha establecido un vínculo causal entre Malassezia y pityriarsis versicolor, el papel fisiopatológico del hongo en patologías cutáneas más severas sigue siendo en gran medida desconocido.
Determinar el papel de Malassezia en la homeostasis de la piel y la enfermedad requiere un conocimiento más profundo sobre la interacción del hongo con la piel y el sistema inmunológico cutáneo. Cabe destacar que la investigación sobre Malassezia es, en comparación con otros patógenos fúngicos humanos (por ejemplo, Candida albicans o Aspergillus fumigatus),todavía en la etapa incipiente. Esto se puede atribuir a la dificultad en el cultivo de Malassezia en condiciones de laboratorio y a la falta de modelos experimentales adecuados para el estudio del hongo en contacto con el huésped in vivo. Experimentos anteriores con células aisladas en cultivo indicaron una amplia gama de interacciones directas e indirectas entre Malassezia y varias células inmunes y no inmunes7. Sin embargo, estos experimentos in vitro sólo recapitulan parcialmente la situación del entorno cutáneo complejo in vivo donde se producen numerosos eventos celulares y moleculares de forma concomitante entre el hongo y varios tipos celulares.
Aquí, delineamos el protocolo para un modelo experimental de infección cutánea de Malassezia en ratones, que establecimos recientemente, para estudiar la interacción hongo-huésped in vivo7. Esto incluye procedimientos para (1) el cultivo exitoso de Malassezia in vitro, (2) la aplicación epicutánea de Malassezia sobre la piel del oído murino, y (3) los detalles técnicos de cómo analizar la piel inducida por Malassezia inflamación y la carga fúngica de la piel infectada. Es importante destacar que este modelo no se basa en la inmunosupresión (por ejemplo, mediante corticoesteroides) o el tratamiento antibiótico de ratones antes de la infección, como se practica en otros modelos de ratón de infección fúngica8,9. A su vez, permite estudiar todo el espectro de la respuesta inmune innata y adaptativa contra Malassezia en la piel normal. Cabe destacar que los ratones de tipo salvaje endogámico mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) no se colonizan naturalmente con Malassezia y, por lo tanto, su exposición al hongo no da lugar a la colonización persistente, sino que se elimina del huésped aproximadamente 1,5 semanas. Sin embargo, el modelo permite estudiar los mecanismos de iniciación y regulación de la respuesta del huésped antifúngico que, a su vez, es la base de cómo se genera la memoria inmune. El modelo es versátil ya que se puede aplicar fácilmente a una amplia variedad de cepas de ratón modificadas genéticamente y se puede combinar con otros modelos existentes de enfermedad de la piel, como modelos de deficiencia de barrera, para estudiar el impacto de Malassezia condiciones patológicas e inflamatorias de la piel7. Por lo tanto, el modelo descrito de infección cutánea experimental de Malassezia en ratones proporciona un alto grado de flexibilidad para investigar la interacción del hongo con el sistema inmunitario de la piel en el contexto de la homeostasis y la enfermedad.
Este protocolo describe la infección cutánea experimental de ratones con Malassezia spp. Debido a su potencial patógeno, Malassezia spp. se clasifican como patógenos BSL2 en algunos países, incluyendo Suiza. Consulte las directrices locales y siga las normas de las autoridades locales. Los organismos clasificados por BSL2 deben ser manejados por personal capacitado bajo un gabinete de bioseguridad (BSC) certificado por BSL2. Los residuos biológicos contaminados con organismos clasificados por BSL2, así como las canales de ratones infectados con dichos organismos, deben autoclaverse antes de su eliminación. Para los experimentos con ratones, se deben hacer todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento y asegurar los más altos estándares éticos y humanos de acuerdo con los principios 3R (reemplazar, refinar, reducir)10. Los experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo con M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) y M. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la infección de la piel de la cepa de ratón endogámica comúnmente utilizada C57BL/6 por Malassezia spp. Adaptación de este protocolo a otras cepas de ratón con un fondo genético diferente (por ejemplo, Balb/c) o a ratón modificado genéticamente las cepas pueden necesitar un ajuste de la dosis de la infección, el punto de tiempo del análisis, etc. Para garantizar la reproducibilidad, los grupos de ratones deben ser siempre de la misma edad y sexo. La fuente de ratones debe mantenerse estable, ya que incluso ligeros cambios en los antecedentes genéticos y diferencias en la microbiota, que existen entre los proveedores y pueden existir incluso entre diferentes unidades de una sola instalación de cría, pueden tener un impacto impredecible en el curso de infección. Al configurar el modelo de infección de Malassezia descrito en este protocolo, se recomienda realizar un estudio piloto para monitorear cuidadosamente el curso de la infección, incluyendo el grado de colonización, la cinética del aclaramiento de hongos y el grado de inflamación y patología que podrían inducirse (por ejemplo, si la piel del oído está interrumpida por barrera antes de la infección) para determinar las condiciones óptimas del ensayo.
Para garantizar la reproducibilidad y detectar de forma fiable las diferencias entre los grupos experimentales, el número de animales utilizados por grupo debe calcularse en función del análisis estadístico. El tamaño de la muestra se calcula en función del tamaño del efecto, la tasa de error y la potencia, que tienen en cuenta las variaciones biológicas y experimentales (por ejemplo, debido a la variación en el sistema inmunitario). Por razones éticas evite el uso innecesariamente alto de animales. En cuanto a la infección cutánea de Malassezia, no se recomienda tratar un solo oído con el hongo y usar el otro oído como control dentro del mismo ratón, ya que los ratones pueden propagar el hongo a ambos oídos al acicalarse. Sin embargo, el uso de 1/2 oído para diferentes lecturas metodológicas tales como la determinación de la carga de hongos, el aislamiento de las células inmunitarias o el análisis histológico es a menudo suficiente y resulta en una reducción significativa en el número de animales utilizados para los experimentos.
18 especies diferentes de Malassezia han sido descritas hasta la fecha. Las variaciones entre especies e intraespecies dentro del género Malassezia pueden afectar la interacción con el huésped, como también hemos aprendido de estudios sobre otros hongos patógenos humanos13. Diferentes especies y cepas de Malassezia difieren en su origen (por ejemplo, M. pachydermatis es la especie más frecuente aislada de los animales, mientras que M. restricta, M. globosa y M. sympodialis son las más miembros prominentes del microbioma de la piel de los hongos en los seres humanos con distribución variable de estas especies entre diferentes áreas de la piel). Algunas especies se han asociado con el commensalismo, mientras que otras se cree que son más patógenas, aunque la evidencia detallada sigue siendo relativamente débil. Es importante destacar que algunas especies y cepas son intrínsecamente más difíciles de cultivar que otras. Por lo tanto, la decisión de qué especies/cepas utilizar para la infección debe basarse en la cuestión de la investigación.
La infección experimental de la piel murina con algunos organismos microbianos como Candida albicans o Staphylococcus aureus requiere la interrupción de la barrera epidérmica antes de la infección, por ejemplo, con papel de lija14, 15,16. Por el contrario, el modelo de infección de Malassezia descrito aquí es igualmente eficiente con y sin interrupción de barrera7. El grado de inflamación inducido por el hongo se mejora masivamente si la piel se despoja antes de la infección7. Por lo tanto, si la piel debe ser manipulada antes de la aplicación de Malassezia depende de la cuestión de investigación. Existen varios modelos de inflamación crónica y aguda de la piel (por ejemplo, modelos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) e hipersensibilidad de contacto (CHS)) y modelos de deficiencia de barrera que pueden ser de interés para investigar la contribución de la levadura commensal a las patologías de la piel.
Los ratones endogámicos mantenidos bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) no son (a nuestro conocimiento) colonizados naturalmente con Malassezia. Por lo tanto, la aplicación experimental de Malassezia a la piel del oído del ratón representa una exposición primaria al hongo que induce una respuesta aguda en el huésped, lo que a su vez conduce al aclaramiento de hongos dentro de 1 – 2 semanas7. Mientras que el modelo descrito en este protocolo, por lo tanto, sólo refleja parcialmente la situación en los seres humanos inmunocompetentes u otros organismos huéspedes que están colonizados permanentemente con Malassezia,la infección experimental permite una amplia ventana de oportunidad de estudiar la inmunidad antifúngica y los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a esta respuesta. También permite investigar variaciones en la respuesta a diferentes especies y cepas de Malassezia bajo diferentes condiciones experimentales (por ejemplo, con y sin interrupción de barrera de la piel).
El estudio de Malassezia – las interacciones del huésped se han limitado en el pasado a experimentos in vitro con tipos de células aisladas en cultivos (por ejemplo, líneas celulares de queratinocitos, PBMCs). Aunque estos estudios han arrojado algo de luz sobre los determinantes de los hongos y el huésped que dan forma a la interacción entre Malassezia y el huésped17,no permiten obtener una comprensión completa del hongo – interacción del huésped en el complejo ambiente de la piel, que implica múltiples tipos de células que están en comunicación constante, tales como queratinocitos, fibroblastos y células inmunitarias residentes en tejidos, pero también poblaciones de leucocitos que se infiltran en el tejido sólo tras el encuentro microbiano de la Piel. Esta red multicelular no se puede reproducir completamente en los modelos in vitro, incluso con los sistemas organoides más avanzados. Por lo tanto, la infección experimental de ratones todavía representa el estándar de oro en inmunología y investigación de enfermedades infecciosas, y la disponibilidad del modelo descrito aquí representa un avance en el campo de la investigación de Malassezia. Es importante destacar que este modelo se basa en la aplicación epicutánea de Malassezia en la piel del oído del ratón, y no implica la inoculación del hongo por inyección en el tejido, por ejemplo, por vía subcutánea o intraperitoneal, como estudios previos reportaron18,los cuales están más distantes de la situación en los huéspedes colonizados naturalmente.
La posibilidad de combinar el modelo de infección de Malassezia descrito en este protocolo con otros modelos de ratón disponibles aumenta en gran medida el alcance y la flexibilidad de la aplicación. Estos últimos incluyen varios modelos de trastornos específicos de la piel, como el modelo de deficiencia de barrera que imita características importantes de la dermatitis atópica, una enfermedad asociada con Malassezia tanto en humanos como en perros. Además, la infección epicutánea de la piel con Malassezia se puede aplicar fácilmente a ratones con defectos genéticos en genes huésped de interés, o ratones en los que un tipo de interés celular se elimina genéticamente o puede agotarse farmacológicamente (por ejemplo, por medios administración de toxinas difteria en ratones que expresan los receptores de toxinas difteria). Estos modelos representan una herramienta inevitable para disuadar la respuesta del huésped a microbios comensales y patógenos, incluyendo Malassezia,y para evaluar el papel de estos genes y el tipo de célula en la interacción hongo-huésped. Los análisis de la interacción de la piel Malassezia-host se pueden ampliar mucho más allá de lo que se describe en este protocolo. Estos incluyen análisis por histología (por ejemplo, para determinar el grado de patología de la piel o el engrosamiento epidente epidente inducido por el hongo), por inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente de secciones de tejido utilizando anticuerpos dirigidos contra el tipo celular marcadores específicos u otras moléculas de interés. También puede implicar el aislamiento de células (por ejemplo, subconjuntos de leucocitos residentes en tejidos o infiltrantes de tejido) del tejido cutáneo infectado para estudiar la polarización, regulación y dinámica de la respuesta inmune a Malassezia en gran profundidad.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue apoyada por la Universidad de Zúrich, Suiza.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | – | – | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
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