Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.
As gravações neurais multiregionais podem fornecer informações cruciais para compreender as interações de escala de tempo fino entre várias regiões cerebrais. Entretanto, os projetos convencionais do Microdrive permitem frequentemente somente o uso de um tipo de elétrodo para gravar das únicas ou das regiões múltiplas, limitando o rendimento de únicas-unidade ou de gravações do perfil da profundidade. Ele também geralmente limita a capacidade de combinar as gravações de eletrodos com ferramentas optogenéticas para direcionar a atividade de caminho e/ou tipo de célula específica. Aqui apresentamos um array híbrido de Microdrive para ratos que se deslocam livremente para otimizar o rendimento e uma descrição de sua fabricação e reutilização da matriz de Microdrive. O projeto atual emprega nove tetrodes e uma ponta de prova do opto-silicone implantada em duas áreas diferentes do cérebro simultaneamente em ratos livremente moventes. O tetrodes e a sonda opto-silício são independentemente ajustáveis ao longo do eixo dorsoventral no cérebro para maximizar o rendimento das atividades unitárias e oscilatórias. Esta matriz de Microdrive também incorpora uma set-up de luz, mediando a manipulação optogenética para investigar as respostas específicas do tipo regional ou celular e funções de circuitos neurais de longo alcance. Além, a ponta de prova do opto-silicone pode com segurança ser recuperada e reúso após cada experimentação. Como a matriz de Microdrive consiste em peças impressas em 3D, o design de microdrives pode ser facilmente modificado para acomodar várias configurações. Descrito pela primeira vez é o projeto da matriz de Microdrive e como anexar a fibra óptica a uma sonda de silício para experimentos de optogenética, seguido pela fabricação do pacote tetrode e implantação da matriz em um cérebro do mouse. A gravação de potencialidades locais do campo e da unidade que spiking combinou com a estimulação optogenética igualmente demonstra a viabilidade do sistema da disposição do Microdrive em ratos livremente moventes.
É crucial compreender como a atividade neuronal apoia o processo cognitivo, tal como a aprendizagem e a memória, investigando como as regiões cerebrais diferentes interagem dinamicamente uns com os outros. Para elucidar a dinâmica da atividade neural subjacente às tarefas cognitivas, a eletrofisiologia extracelular em grande escala tem sido conduzida em animais que se deslocam livremente com o auxílio de matrizes de Microdrive1,2,3, a 4. Nas últimas duas décadas, vários tipos de Microdrive array foram desenvolvidos para implantar eletrodos em múltiplas regiões cerebrais para ratos5,6,7,8 e camundongos9, 10 de , 11 anos de , 12. no entanto, os projetos atuais do Microdrive geralmente não permitem o uso de tipos múltiplos da ponta de prova, forçando investigadores a escolher um único tipo do elétrodo com benefícios e limitações específicos. Por exemplo, as matrizes tetrode funcionam bem para regiões cerebrais densamente povoadas, como o hipocampo dorsal CA11,13, enquanto sondas de silício dão um melhor perfil geométrico para estudar conexões anatômicas14 , quinze anos.
Tetrodes e sondas de silício são freqüentemente usados para gravação in vivo crônica, e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Tetrodes provaram ter vantagens significativas na melhor isolação da única unidade do que os únicos elétrodos16,17, além do que a eficácia de custo e a rigidez mecânica. Eles também fornecem rendimentos mais elevados de atividades de unidade única quando combinados com microdrives8,18,19,20. É essencial aumentar o número de neurônios simultaneamente gravados para compreender a função dos circuitos neurais21. Por exemplo, um grande número de células é necessário para investigar pequenas populações de tipos de células funcionalmente heterogêneas, como22 ou recompensa relacionadas ao tempo23 células. Os números de pilha muito mais elevados são exigidos para melhorar a qualidade da decodificação de seqüências do ponto13,24,25.
Tetrodes, no entanto, tem uma desvantagem na gravação de células distribuídas espacialmente, como no córtex ou no tálamo. Em contraste com tetrodes, sondas de silício podem fornecer distribuição espacial e interação de potenciais de campo local (lfps) e atividades de spiking dentro de uma estrutura local14,15. As sondas de silício com várias hastes aumentam ainda mais o número de locais de gravação e permitem a gravação em estruturas únicas ou vizinhas27. Entretanto, tais matrizes são menos flexíveis no posicionamento de locais do elétrodo comparados a tetrodes. Além disso, os algoritmos de classificação de Spike complexos são necessários em sondas de alta densidade para extrair informações sobre potenciais de ação de canais vizinhos para espelhar os dados adquiridos por tetrodes28,29,30. Daqui, o rendimento total de únicas unidades é frequentemente menos do que tetrodes. Além disso, as sondas de silício são desvantajosas devido à sua fragilidade e alto custo. Assim, a escolha de tetrodes vs. sondas de silício depende do objetivo da gravação, que é uma questão de saber se a obtenção de um alto rendimento de unidades únicas ou perfil espacial nos locais de gravação é priorizada.
Além de registrar a atividade neural, a manipulação optogenética tornou-se uma das ferramentas mais poderosas na neurociência para examinar como tipos específicos de células e/ou caminhos contribuem para as funções do circuito neural13,31, 32,33. Entretanto, as experiências optogenética exigem a consideração adicional no projeto da disposição do Microdrive para unir o conector da fibra às fontes luminosas da estimulação34,35,36. Muitas vezes, a conexão de fibra óptica requer uma força relativamente grande, o que pode levar a uma mudança mecânica da sonda no cérebro. Portanto, não é uma tarefa trivial para combinar uma fibra óptica implantável para matrizes de Microdrive convencionais.
Pelas razões acima, os pesquisadores são obrigados a otimizar a seleção do tipo de eletrodo ou para implantar uma fibra óptica, dependendo do objetivo da gravação. Por exemplo tetrodes são usados para alcançar maior rendimento unitário no hipocampo1,13, enquanto sondas de silício são usadas para investigar o perfil de profundidade laminar de áreas corticais, como o córtex entorrinal medial (MEC)37. Atualmente, microdrives para implantação simultânea de tetrodes e sondas de silício haviam sido relatados para os ratos5,11. No entanto, é extremamente desafiador para implantar múltiplas sondas de tetrodes e silício em camundongos por causa do peso dos Microdrives, espaço limitado na cabeça do mouse e requisitos espaciais para projetar o Microdrive para empregar diferentes sondas. Embora seja possível implantar sondas de silício sem um Microdrive, este procedimento não permite o ajuste da sonda e diminui a taxa de sucesso da recuperação da sonda de silício12,38. Além disso, experimentos optogenéticos exigem considerações adicionais no design de matriz de Microdrive. Este protocolo demonstra como construir e implantar uma disposição do Microdrive para a gravação crônica em ratos livremente moventes, que permite a implantação de nove tetrodes independente ajustável e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone. Esta matriz de Microdrive também facilita experimentos optogenéticos e recuperação da sonda de silício.
O protocolo demonstra como construir e implantar uma matriz de Microdrive híbrida que permite a gravação de atividades neurais de duas áreas cerebrais usando tetrodes ajustável independente e uma sonda de silício em camundongos que se comportam livremente. Também demonstra experimentos optogenéticos e a recuperação da sonda de silício após experimentos. Quando a ponta de prova ajustável33 do silicone ou a sonda do opto-silicone36 a implantação for demonstrada…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pela sociedade do Japão para a promoção da ciência de bolsas de pesquisa no exterior (HO), programa de estudioso dotado (TK), programa de ciência da fronteira humana (TK), Brain Research Foundation (TK), faculdade de ciência e tecnologia de aquisição e Programa da retenção (TK), cérebro & Fundação da pesquisa do comportamento (TK), e pelo concessão da pesquisa da Fundação de Sumitomo (JY), concessão nova da pesquisa do investigador de NARSAD (JY). Agradecemos a W. Marks por comentários valiosos e sugestões durante a preparação do manuscrito.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |