전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

주사 전자 현미경 (SEM) 초구조 분석 및 세포 내 이미징 은 원핵 생물, 식물 및 동물의 3 차원 프로파일링을위한 광 현미경 검사법을 보완합니다. SEM의 높은 공간 해상도는 나노미터에서 마이크로미터 척도까지 시편의 미세 구조적 특성을 검사하는 데 사용할 수 있는 가장 다재다능하고 강력한 기술 중 하나입니다. 건조 된 표본은 기능적 관계에 대한 유효한 결론을 개발하기위한 기초를 제공하는 강렬한 세부 사항으로 조성및 지형 구조로 해결1,^{2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9}. 생물학적 표본의 SEM 이미지를 해석 할 때, 그것은 네이티브 구조와 처리 중에 생성 된 유물을 구별하는 큰 도전이다. SEM은 일반적으로 샘플^{10,11로부터}방출되는 1차, 이차 또는 역산 전자 빔에 영향을 미치는 가스 분자로부터의 어떠한 간섭을 피하기 위해 매우 높은 진공에서 작동한다. 또한 생물학적 물질은 가난하거나 비전도성 특성으로 인해 방사선 손상에 취약합니다. SEM에 적재된 시편은 고진공^{환경(10,11)에서}발생하는 모든 배출을 제거하기 위해 모든 유기 오염물질이 완전히 건조되고 프리되어야 한다. 생물학적 표본은 대부분 물로 구성되어 있기 때문에, 네이티브 구조물이 유지되도록 하기 위해 추가적인 준비 기술이 필요합니다.

얻어진 해상도는 시편 유형 및 활용된 기악 파라미터에 특정한 준비 방법을 최적화하는 데 기반을 두고 있습니다. 따라서 모든 조직 유형에 대해 일반화 된 처리 단계를 사용하지 않아도됩니다. 일부 생물학적 표본은 구조를 보존하기 위해 덜 엄격한 처리가 필요하며 수축 및 붕괴와 같은 건조 아티팩트의 도입을 피하기 위해 섬세한 유형의 시료에 더 많은 시간과 주의가 필요할 수 있습니다. 시료 전처리는 SEM 이미징에서 중요한 단계입니다. 형태측정 연구의 결과는 표본 준비 절차^12,13에의해 현저하게 영향을 받습니다. 많은 생물학적 시료에 대한 일반적인 준비 단계는 금, 백금 또는 팔라듐과 같은 금속으로 고정, 탈수 및 코팅을 통해 표면을 SEM 분석을 위한 전도성으로 변환합니다. 사용된 단계의 성질 및 조합은 조직의 유형 및 연구의 특정 목표에 따라 달라질 것이다. 전하 축적, 진공 및 전자 빔 손상에 대한 민감성은 부드러운 섬세한 생물학적 샘플을 처리할 때 문제를 야기하며, 물체의 기본 구조를 유지하기 위한 추가 처리 단계가 필요합니다. 오스뮴 테트옥사이드 고정, 탈수 등의 종래의 방법을 사용하여 14,^15,16,17의섬세한 조직의 수축 및 붕괴를 야기한다. 이 연구의 목적은 초기 연구의 아이디어를 준비하고 이미지화하기 위한 수정과 결합하여 파생된 우아한 방법론을 확립하는 것입니다(예: 파충류 배아, 페인트거북이의 달걀 껍질, 곰팡이 문화).

적합한 고정 방법의 선택은 생물학적 표본의 현미경 분석을위한 첫 번째 가장 중요한 단계입니다. 유기체로부터 분리 된 직후 조직을 고정하는 것은 분해로 인한 형태 변경을 방지하는 데 필수적입니다. 효과적인 고정식은 세포에 신속하게 침투하여 세포 과정을 종료하고 SEM^17하에서 후속 처리 단계 및 검사를 모두 견딜 수 있도록 시료의 구조를 안정화시키는 효과를 비가역적으로 유지해야 합니다. ^{, 18}. 여러 화학 적 및 물리적 고정 방법이 알려져 있지만, 화학 적 고정은 자동 용해, 부패 및 건조 효과로 인한 세포 변화를 피하기 위해 생물학적 표본에 더 일반적으로 사용됩니다. 문학^{17,19,20,21,22,23,}변성 및 생물학적 거대 분자를 응고하고, 공유적으로 가교하는 거대 분자에 의해 고쳐진 분자. 알코올은 매우 가난하게 초구조를 보존하는 변성 고정제로 사용되며 주로 가벼운 현미경 검사법에 사용되며 전자 현미경 분석에는 권장되지 않습니다. 포름알데히드, 글루타랄데히드 및 오스뮴 테트옥사이드와 같은 가교 고정제는 조직 내의 거대 분자 간에 분자 간 및 분자 간 가교를 생성하여 초구조체^{11의 우수한 보존을 제공합니다. ,24,25,26}. 생물학적 샘플은 온도에 민감합니다. 고정의 시작 부분에 온도는 막 단백질의 측면 이동성을 감소시키고, 세포 간 분자의 확산을 늦추고, 고정 속도(11)를느리게 하기 위해 4°C로 하는 것이 좋습니다. 조직 을 고정하는 데 필요한 시간은 주로 시료의 크기와 고정이 시편의 구성 요소와 반응하는 속도에 달려 있습니다. 4°C에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드의 하룻밤 고정은 더 작은 섬세한 샘플을 처리 할 수 있도록 순차적 침투 특성에 대해본 연구에 사용되는 표본의 SEM 분석을위한 바람직한 방법입니다^{17 , 18세 , 19세 , 20개 , 27}. 오스뮴 테트옥사이드를 이용한 사후 고정 단계는 독성 특성으로 인해 제거될 뿐만 아니라 본 연구에서 분석된 샘플의 이미지 품질을 향상시키는 추가적인 이점을 구현하지 못하는 것으로 나타났다.

생물학적 샘플에는 SEM 작동을 방해하는 유체가 포함되어 있습니다. 따라서 샘플을 SEM 샘플 챔버에 삽입하기 전에 건조해야 합니다. 탈수가 보장되면 표면 장력/건조로 인해 시편에 아티팩트를 만들지 않고 조직에서 용매를 제거해야 합니다. 세 가지 다른 건조 방법은 SEM 이미징을위한 조직을 처리하는 동안 일반적으로 사용되었다 : 공기 건조, 임계 점 건조, 및 동결 건조 샘플^28,29,30,31. 동물 조직 샘플^{28,29,30,31과}동일한 결과를 생성하는 세 가지 건조 방법 모두를 보고하는 연구는 거의 없습니다. 더 작은 견본을 위해 이용되는 일반적인 방법은 알콜과 hexamethyldisilazane (HMDS)의 상승 농도 시리즈에 의하여 화학적 탈수입니다, 그러나 더 큰 견본은 임계 점 건조 (CPD) 계기^32를사용하여 건조됩니다. 건조 과정에서, 액체/기체 계면에 의해 시편을 통과하는 작은 공동에서 형성된 상당한 힘; 이것은 심지어 중공 구조^(33)의완전한 붕괴로 이어질 수 있습니다. 처리로 인해 발생하는 모든 변형은 시편의 기본 구조 적 특징으로 오인 될 수 있습니다. 따라서, 처리를 위한 일반화현상은 제거되어야 하고 섬세한 조직 견본이 분석될 때 특히 조직의 각 모형을 위한 유일한 건조 프로세스가 표준화되어야 합니다.

위에서 언급한 모든 프로세스의 다양한 조합을 사용하여 수행된 여러 시험에서 파충류 배아, 페인트 거북이의 달걀 껍질 및 곰팡이 배양이라는 세 가지 섬세한 조직의 SEM 분석에 사용할 수 있는 방법을 표준화했습니다. 발달 생물학자와 형태학자는 대표적인 척추동물에서 배아 발달 중에 정상적이고 비정상적인 형태 형성을 설명합니다. 유전자 신호 통로에 대한 조사는 새로운 구조의 형태학적 설명에 달려 있습니다. SEM 분석 도중 척추동물 배아 구조에 있는 어떤 급격한 변경든지 피하기 위하여는, 우리는 탈수다음 화학건조를 추천합니다. HMDS를 이용한 화학건조는 비교적 최신의 건조 방법이며 상대적 민첩성, 사용 편의성, 비용손실, 필요한 제한된 전문 지식 및 장비 9. CPD는 특정 온도 및 압력에서 시편에 걸쳐 CO2를 통과하는 것을 사용하여 일반적으로 사용되는 건조 기술입니다. 우리는 HMDS가 연약한 섬세한 조직을 건조시키기에 적합하고 배아 조직에 광대한 변형을 일으킨 임계 점 건조에 비해 더 큰 샘플을 가공할 수 있다는 것을 확인했습니다. 몇몇 방법은 균류^34의형태학적 특성을 공부하기 위하여 SEM 화상 진찰을 위한 견본을 준비하기 위하여 이용되었습니다. 곰팡이 시편은 일반적으로 오스뮴 테트옥사이드에 고정된 후 에탄올 탈수 및 임계 점 건조가 뒤따르며, 이는 오스뮴 테트옥사이드^6,7,35의 독성 효과가 있지만 만족스러운 결과를 제공할 수 있습니다. 처리 하는 동안 솔루션을 변경 하는 동안 곰 팡이 재료를 잃고 단점이 발음 된다. 고정없이 공기 건조를 이용한 시료 전처리 기술도^36개 시행되었으나 수축 및 붕괴된 구조물을 초래하며, 이러한 시편의 관찰은 종을 특성화하면서 쉽게 잘못 해석될 수 있다. 곰팡이 하이pha는 액체와 접촉하는 무결성을 잃고 심지어 건조는 구조를 복원하기 위해 달성되지 않을 수 있습니다. 이 효과 로 인해, 동결 건조는 일반적으로 곰 팡이 균 사 체와 같은 연약한 조직을 건조에 사용 됩니다. 동결 건조는 깨끗한 재료에 적합하지만 염이나 분비물의 존재는 SEM 보기 단계에서만 식별되는 표면 세부 사항을 모호하게 합니다. 우리는 글루타랄데히드 고정 및 임계 점 건조와 슬라이드 배양 방법을 결합하여 손상되지 않은 곰팡이 하이페 및 포자의 구조적 세부 사항을 산출합니다. CPD 건조는 배아의 수축을 일으켰지만, 글루타랄알데히드 고정과 결합될 때 잘 보존된 균사 구조가 발생했습니다. 달걀 껍질은 보호 커버링 역할을 할뿐만 아니라 기계적 안정성, 가스와 물에 대한 투과성 및 개발 배아를위한 칼슘 예비를 제공함으로써 oviparous 동물의 배아에 1 차적으로 중요합니다. 민물 거북 달걀 껍질은 구조에 따라 “경직된”으로 분류되며, 그가용성으로 인해 생물학자 1, 2,^3,4에서 상당한 관심을 받고 있습니다. ^{, 5개 , 6개 , 7명 , 37세 , 38}.

우리는 어떤 단단한 계란 껍질 종에 적용 할 수있는 페인트 거북이의 계란 껍질과 껍질 막의 쉬운 검사를위한 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 준비 방법론은 결과이미지 품질과 감소된 잠재적 아티팩트를 기반으로 평가되었습니다.