人类干细胞衍生的伊拉尔肠细胞单层中M细胞样细胞的诱导分化

此处描述的所有方法均已获得塔夫茨大学 IBC 和 IRB 的批准。 1. 诱导M细胞分化在人类肠道衍生单层 注:该协议使用从人体组织活检中提取的肠状体。请参阅已公布的协议,了解如何生长和传递这些细胞18,24。以下单层开发方法改编自Zou等人24。诱导M细胞在肠衍生培养物中诱导的方法从以前的报告21、22、23改编而成。所有工作都在无菌组织培养罩中进行,孵化在罩或组织培养箱中,如所示。参见制备肠状单层和各种介质所需的材料表。 在细胞外基质(ECM)中生长4-10天(参见材料表)(图1),取决于其内在生长速率,然后再播种到透水井上。 涂层跨井膜 将所需数量的跨孔放入 24 孔板中,形成双腔系统。 在冷无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中稀释 ECM 25 倍,并将 100 μL 的冷稀释溶液添加到膜上的每个上腔。注:ECM 和稀释的 ECM 溶液必须保持在冰上,直到添加前立即。 用盖子盖住24孔板,将板放入37°C的组织培养箱中2小时,使ECM在膜上凝固。 2小时后,从培养箱中取出板,放入组织培养罩中。使用无菌钳子,反转每个转井,轻轻去除剩余的溶液。在收集细胞时,让膜在盖打开的情况下在引擎盖中通风(步骤 1.3.1- 1.3.11)。 将肠子分离到单个细胞中 从培养箱中取出肠子板,通过真空吸气或移液器从每个孔中轻轻去除培养膜。注:一口含有大约100个健康囊肿的肠球菌井就足以成为1.5-2口井的种子。 在每个井中加入 500 μL 的冰冷 0.5 mM 乙烯二甲酸 (EDTA),每口井中含有悬浮在 ECM 中的肠子,以分解 ECM。使用 P1000 移液器在 500 μL 处大力上下移液,以分解 ECM,从而将回肠细胞释放到溶液中。为了改善ECM的溶解,移液后,在4°C下用力摇动板30分钟。 将溶液从每个孔收集到15 mL锥形管中。注:每 15 mL 锥形管收集多达 10 口孔,以获得最佳的单细胞收集。 在140 x g和4°C的离心机中将细胞颗粒5分钟。注:如果担心颗粒和细胞的丢失,请使用移液器,并将上清液保存在单独的管中。 为了消化紧密的结连结,将肠子分解成单个细胞,在步骤1.3.3中每5口井中每5口井中重新悬浮500μL室温胰蛋白酶。使用 P1000,上下移液器将管块分解,并在 37°C 水浴中孵育管 5 分钟或更少。注:需要优化以确定孵育管所需的适当时间,以便细胞被分解,而不是过度试穿到它们死亡时。在步骤 1.3.9 中使用胰蛋白酶蓝色,以确保胰蛋白酶治疗后细胞是可存活的。 每500μL的胰蛋白酶加入1mL的高级DMEM/F12,每500μL的10%胎儿牛血清(FBS)使胰蛋白酶灭活。 将P1000设置为500μL,至少50次,在锥形管的侧面上下移液,以进一步将剩余的团块分解为单个细胞。 将 40 μm 细胞滤网置于 50 mL 锥形上,并添加 1 mL 的高级 DMEM/F12,并加入 10% FBS 来润湿细胞滤网。将单细胞悬浮液从 15 mL 锥形移到滤网上。使用 10% FBS 清洗 1 mL 高级 DMEM/F12 的滤网。 将穿过细胞滤网的细胞从50 mL锥形转移到新的15 mL锥形管中。在离心步骤 1.3.10 期间,细胞颗粒在 15 mL 锥形管中更容易看到。使用血细胞计对细胞进行计数。使用 Trypan 蓝色验证单元格是否还活着。通常,观察到 >95% 的生存能力。 在计算细胞时,在400 x g和室温下,将新15 mL管中的细胞离心5分钟。用移液器小心地去除上清液,再次保存上清液,以防颗粒脱落。 准备经过修改的完整生长介质25 (MCMGF® 介质) 辅以 10 μM Y-27632。在MCMGF+中,在2.5 x 105细胞/200μL处重新悬浮颗粒细胞。请参阅有关优化细胞种子编号的讨论说明。注:MCMGF® 介质是高级 DMEM/F12,具有 75% L-Wnt3a 调节介质, 10% R-spondin 调节介质, 5% Noggin 调节介质, 1x B27 补充剂, 1x N2 补充剂, 1 mM N-乙酰半胱氨酸, 50 ng/mL 小鼠重组 EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]-Gastrin I,10 mM HEPES、2 mM 谷氨酸MAX 和 1x 青霉素/链霉素(可选)。 确保步骤 1.2 中制备的 ECM 涂层膜已完全干燥,经眼部评估。用 200 μL 的 MCMGF® 清洗上腔。在每个上腔室中加入200μL的细胞溶液。 在每个下腔室中加入700μL的MCMGF+,每个腔室10μM Y-27632。将板放入37°C组织培养箱中,CO2为5%。 生长1天后,从上腔室中取出介质,用200μL的新鲜MCMGF®替换,以防止多个细胞层的生长。 更换介质 一旦单层体达到 +80% 的康成,通常在播种后 1-3 天之间,用分化介质 (DM) 替换巴索侧介质以控制井(有关更多详细信息,请参阅步骤 1.4.2)或 M 细胞介质(有关更多详细信息,请参阅步骤 1.4.3)。在这两种情况下,用 DM 替换上腔室中的介质。注:DM 是高级 DMEM/F12,具有 5% 诺金调节介质, 1x B27 补充剂, 1x N2 补充剂, 1 mM N-乙酰半胱氨酸, 50 ng/mL 小鼠重组 EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15] – Gastrin I, 10 mM HEPES 缓冲液, 2 m M GlutaMAX, 和 1x Penicillin/链霉素 (可选).M细胞介质由200纳克/mL RANKL和50纳克/mL TNF+补充。 对于不应包含 M 细胞的控制井,向上腔室添加 200 μL DM,向底部腔室添加 700 μL DM。 要诱导M细胞,将200μLDM添加到上腔室,将700μL的M细胞介质添加到底部腔室。 每 2 天更换一次介质。对于控制井,在上腔和下腔更换 DM。对于 M 单元孔,在上腔室中更换 DM,在下腔室中更换 M 单元介质。注:到第7天后细胞播种,M细胞完全诱导在单层。 2. 通过qRT-PCR验证M细胞分化 注:在无菌无RNAe工作台空间执行以下工作。有关 qRT-PCR 的首选材料列表,请参阅材料表。 从上腔和底部腔室中取出介质,用 300 μL 室温 PBS 轻轻清洗上腔室 2 倍。 在每个上腔室中加入 300 μL 的三佐尔。在室温下孵育5分钟。注意:使用 Trizol 时,请戴上手套和护目以,避免接触制造商说明中所示的皮肤。 同时,为每个井标出微离心管,并在每口管中加入700μL的Trizol。 用P1000轻轻上下移液3x,收集细胞均质,并将内容物转移到相应的微离心管中。涡旋5s混合。 将样品保存在室温下3分钟。然后在-80°C下储存一个月。 遵循标准qRT-PCR方法进行RNA分离、DNase治疗、逆转录和qRT-PCR反应。请参阅材料表中的引物列表。 3. 通过免疫荧光验证M细胞分化 注:始终保持板的下室充满 PBS,使膜保持湿润。此过程在工作台上执行。有关免疫荧光的首选材料列表,请参阅材料表。 从上室取下介质,用 300 μL 室温 PBS 轻轻清洗 2 次。在PBS中加入100μL室温4%PFA到上室室。用铝箔盖住板,在室温下站立 25 分钟。去除 4% PFA。注意:4% PFA 应作为危险化学品废物正确处置。 用300μL室温PBS清洗上室3倍。此时,样品在染色前可保持在 4°C 下长达一个月。一旦染色,样品应在一周内可视化,以获得最佳质量的图像。 用100μL的5%牛血清白蛋白(BSA)孵育在室温下在PBS中溶解30分钟,以阻止单层。 在PBS中制备1%BSA的GP2原抗体溶液,稀释1:100。每口加100 μL。在黑暗中室温下染色1小时。删除解决方案。注:在GP2发生原发性染色之前不要渗透单层,因为M细胞的最佳原发性GP2表面染色无需渗透即可实现。 用300μL室温PBS清洗上室3次。 在 1:200 时制备荧光标记山羊抗小鼠 IgG 的二次染色溶液,在 1:100 时制备 phalloidin,在 PBS 中制备 1% BSA+ 0.1% 三吨中的 DAPI。每口加100 μL。在黑暗中室温下染色30分钟。注:Triton 被添加到二次染色溶液中,以渗透这一步骤中的细胞,以进行适当的 phalloidin 染色。 用 300 μL PBS 洗涤 3 次。 将 5 μL 的安装溶液 (材料表) 放在玻璃滑块上。从 24 孔板中取出井并反转。使用手术刀小心地从井中切割膜。将电池朝上放在玻璃滑轨上安装溶液的液滴上。将 10 μL 的安装溶液添加到膜的顶部和中心,并在顶部放置一个盖玻片,以密封玻璃滑片和盖玻片之间的膜。 在黑暗中将幻灯片在室温下干燥 24 小时。染色的幻灯片应在染色后 1 周内在共聚焦显微镜上可视化。