ヒト幹細胞由来腸腸単層におけるM細胞様細胞の誘導分化

ここに記載されているすべての方法は、タフツ大学IBCとIRBによって承認されています. 1. ヒト腸腸状単層におけるM細胞分化の誘導 注:このプロトコルは、ヒト組織生検に由来する腸腸を使用する。これらの細胞を成長させ、通過する方法については、公開されたプロトコルを参照してください18,24.単層を開発するための以下の方法は、Zou et al.24から適合した。腸腸状由来培養におけるM細胞を誘導する方法は、以前の報告21、22、23から適応した。すべての作業は、無菌組織培養フードで行われ、インキュベーションは、示されているようにフードまたは組織培養インキュベーター内にある。腸腸腸単層および各種媒体を調作成するために必要な材料の表を参照してください。 細胞外マトリックス(ECM)で4〜10日間イレアルエンテロイドを成長させる(図1参照)。 コーティングトランスウェル膜 24ウェルプレートに所望のトランスウェルを配置し、2チャンバシステムを作成します。 冷たい無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)でECMを25倍希釈し、膜上の各上部チャンバーに100μLの冷たい希釈溶液を加えます。注:ECMおよび希釈されたECM溶液は、添加直前まで氷上に保持する必要があります。 蓋で24ウェルプレートを覆い、37°Cの組織培養インキュベーターに2時間置き、膜上のECM固化を可能にします。 2時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、組織培養フードに入れます。滅菌ピンセットを使用して、各トランスウェルを反転させ、残りの溶液を穏やかに除去する。細胞が集められている間、蓋を開けたままフードの中で膜をエアドライにします(ステップ1.3.1- 1.3.11)。 腸内腸を単一細胞に解離する インキュベーターから腸エンテロイドのプレートを取り出し、真空吸引またはピペットで各ウェルから培養培地を静かに取り除きます。注:約100の健康な嚢胞を含む腸エンテロイドの1つの井戸は、1.5-2ウェルを播種するのに十分である。 ECMに懸濁した腸エンテロイドを含む各ウェルに500μLの氷冷0.5mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)を加えてECMを分解します。P1000ピペッターを500μLに設定して激しく上下にピペットを入れ、ECMを分解し、溶液中にイレアルエンテロイドを放出します。ECMの溶解を改善するために、ピペッティング後、プレートを4°Cで30分間激しく振る。 各井戸から15 mL円錐形のチューブに溶液を収集します。注:最適の単一細胞のコレクションのための15 mL円錐形の管ごとの10までの井戸を集める。 ペレットは140 x gと4°Cの遠心分離機で5分間ペレットが見えるはずですが、簡単に脱落することができるので、真空吸引またはピペットで上清をゆっくりと除去します。注:ペレットと細胞の損失が懸念される場合は、ピペットを使用し、別のチューブに上清を保存します。 タイトなジャンクションリンケージを消化し、腸内腸を単一の細胞に分割するには、ステップ1.3.3で収集された5ウェルごとに室温トリプシンの500 μLでペレットを再中断します。P1000を使用して、上下にピペットを上下に凝縮し、5分以下の37°Cの水浴でチューブをインキュベートします。注:最適化は、細胞が分解されるが、死ぬまで過剰にトライプシン化しないようにチューブをインキュベートするのに必要な適切な時間を決定するために必要です。ステップ1.3.9でトリパンブルーを使用して、トリプシン処理後に細胞が生存可能であることを確認します。 トリプシンの500 μLあたり10%の胎児牛血清(FBS)で高度なDMEM/F12の1 mLを追加し、トリプシンを不活性化します。 P1000を500μLに500μLに設定して上下にピペットを、円錐管の側面に対して少なくとも50回、残りの塊をさらに単一細胞に分解する。 40 μmセルストレーナーを50 mLの円錐形の上に置き、10Sで高度なDMEM/F12の1 mLを加えてセルストレーナーを濡らします。15 mL円錐形からストレーナーに単一セル懸濁液をピペット。高度なDMEM/F12の1 mLでストレーナーを10Sで洗浄します。 50 mL円錐形からセルストレーナーを通過した細胞を新しい15 mL円錐管に移します。遠心分離ステップ1.3.10の間に、細胞ペレットは15 mL円錐形の管でより容易に見られる。血球計を使用して細胞を数えます。トリパンブルーを使用して、セルがまだ生きていることを確認します。典型的には、>95%の生存率が観察される。 細胞を数えながら、新しい15 mLチューブ内の細胞を400 x gで遠心分離し、室温を5分間見えるようにする必要があります。ピペットで上清を慎重に取り除き、ペレットが脱落した場合に備えて上清を保存します。 10 μM Y-27632を補充した修飾完全増殖培剤25(MCMGF+培中)を調製する。MCMGF+で2.5 x 105細胞/200 μLでペレット化した細胞を再中断します。セルシード数の最適化に関する説明を参照してください。注:MCMGF+ メディアは、75% L-Wnt3a 条件付きメディアを備えた高度な DMEM/F12 です。 10% R-スポンドイン条件付き媒次剤, 5% ノギン条件付き培地, 1x B27 サプリメント, 1x N2 サプリメント, 1 mM N-アセチルシステイン, 50 ng/mL マウス組換え EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]ガストリン I,10 mM HEPES、2 mMグルタマックス、および1xペニシリン/ストレプトマイシン(オプション)。 ステップ1.2で調製したECM被覆膜が、目で評価されているように完全に乾燥していることを確認してください。MCMGF+の200 μLで上部のチャンバを洗浄します。各上部チャンバに200μLの細胞溶液を加えます。 各下部チャンバに10 μM Y-27632を含むMCMGF+の700 μLを追加します。5%CO2で37°C組織培養インキュベーターにプレートを置きます。 成長の1日後、上部のチャンバーから培画像を取り出し、新鮮なMCMGF+の200 μLに置き換え、複数の細胞層の増殖を防ぎます。 媒体の置き換え 単層が~80%コンフルエント(通常は1~3日目のシード後)に、対照ウェルの分化媒体(DM)に置き換えるか(詳細についてはステップ1.4.2を参照)、またはM細胞誘導ウェルのMセルメディアを使用します(詳細についてはステップ1.4.3を参照)。両方の条件の DM で上部のメディアを交換します。注:DMは5%のノギン条件付きメディアと高度なDMEM/F12です, 1x B27サプリメント、1x N2サプリメント、1mM N-アセチルシステイン、50 ng/mLマウス組換えEGF、50nM A-8301、10nM [Leu15]-ガストリンI、10 mM HEPESバッファ、2 mMグルタマックス、および1xペニックペニン).M細胞培養は、200 ng/mL RANKLおよび50 ng/mL TNFαを補充したDMである。 M細胞を含まないコントロールウェルの場合は、上部チャンバに200 μLのDMを追加し、底部チャンバに700 μL DMを追加します。 M細胞を誘導するには、上部チャンバに200μLのDMを加え、底部チャンバに700μLのM細胞培中を加える。 2 日ごとにメディアを交換します。制御ウェルの場合は、上下のチャンバーで DM を交換してください。M細胞ウェルの場合は、上部チャンバのDMと下部チャンバのM細胞培中にDMを交換してください。注:7日目までに、M細胞は単層において完全に誘導される。 2. qRT-PCRによるM細胞分化の検証 注:無菌RNAEフリーベンチスペースで以下の作業を行います。qRT-PCR の優先材料の一覧については、資料表を参照してください。 上部および下部のチャンバーからメディアを取り外し、室温PBSの300 μLで上部のチャンバ2xを穏やかに洗います。 各上部のチャンバーに300 μLのトリゾールを追加します。室温で5分間インキュベートします。注意:メーカーの指示に従って皮膚との接触を避けるためにトリゾールを使用する場合は、手袋と目の保護を着用してください。 一方、各ウェルにマイクロ遠心管をラベル付けし、各チューブに700 μLのトリゾールを追加します。 P1000で3倍のピペッティングで細胞均質を収集し、対応するマイクロ遠心管に内容物を移します。5sを混合するための渦。 サンプルを室温で3分間保持します。その後、最大1ヶ月間-80°Cで保存します。 RNA単離、DNase処理、逆転転写およびqRT-PCR反応に関する標準的なqRT-PCR方法論に従ってください。材料の表のプライマーリストを参照してください。 3. 免疫蛍光によるM細胞分化の検証 注:常に膜が濡れているようにPBSで満たされたプレートの下部の部屋を維持します。この手順は、ベンチで実行されます。免疫蛍光に関する好ましい材料のリストについては、材料の表を参照してください。 上部のチャンバから培温を取り外し、室温PBSの300μLで2xを穏やかに洗います。室温4%PFAの室温の100 μLを上部のチャンバーに加えます。プレートをホイルで覆い、室温で25分間放置します。4% PFA を削除します。注意:4%のPFAは、有害な化学廃棄物として適切に処分されるべきです。 室温PBSの300 μLで上部のチャンバ3xを洗浄します。この時点で、サンプルは染色の前に1ヶ月間4°Cに残ることができます。一度染色したら、サンプルは最高の品質の画像のために1週間以内に視覚化する必要があります。 5%の牛血清アルブミン(BSA)の100 μLで単層をインキュベートし、室温で30分間PBSに溶解し、単層を遮断する。 1:100の希釈でPBSで1%BSAでGP2一次抗体溶液を調出します。ウェルあたり 100 μL を追加します。暗闇の室温で1時間の汚れ。ソリューションを削除します。注:M細胞の最適な一次GP2表面染色が透過的に達成されるため、GP2の一次染色が生じる前に単層を透過化しないでください。 室温PBSの300 μLで上部のチャンバを3倍に3倍洗います。 蛍光タグ付きヤギ抗マウスIgGの二次染色液を1:200、ファロイジンを1:100で、DAPIを1%BSA+0.1%のトリトンでPBSに調製する。ウェルあたり 100 μL を追加します。暗闇の中で室温で30分間汚れます。注:トリトンは、適切なファロイジン染色のためにこのステップ中に細胞を透過化する二次染色液に添加される。 300 μL PBS で 3x を洗浄します。 ガラススライドに5μLの取り付け液(材料の表)を置きます。24ウェルプレートからウェルを取り出し、反転します。慎重にメスを使用して井戸から膜をカットします。ガラススライド上の取り付け溶液の液滴の上に上向きの細胞と膜を置きます。10 μLの取り付け液を膜の上部と中心に追加し、カバースリップを上に置き、ガラススライドとカバースリップの間の膜をシールします。 24時間の暗闇の中で室温でスライドを乾燥させる. 染色されたスライドは、染色後1週間以内に共焦点顕微鏡で視覚化する必要があります。