Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

O HTPP faz uso da tecnologia de Microarray de ligação ao DNA combinada com a análise bioquímica (Figura 1) para identificar estatisticamente as características específicas dos modelos de DNA que afetam a atividade enzimática da PRIMASE do DNA. Portanto, a HTPP fornece uma plataforma tecnológica que facilita um salto de conhecimento no campo. As ferramentas clássicas usadas para determinar os locais do reconhecimento do primase não têm a habilidade de render a quantidade maciça de dados, visto que HTPP faz.

A PBM é uma técnica rotineiramente utilizada para determinar as preferências vinculativas dos fatores de transcrição ao DNA^1,2; Entretanto, não é apropriado para a deteção da ligação fraca/transiente das proteínas ao ADN. Ao contrário do universal PBM que fornece informações sobre a especificidade de ligação de proteínas média para todas as seqüências possíveis consistindo de oito pares de base, HTPP é baseado na biblioteca de modelos de DNA single-encalhado compreendendo elementos de seqüência única. Tais elementos de sequência de DNA envolvem dezenas de milhares de sequências genómicas curtas (poucas dezenas de BP), bem como sequências de DNA computacionalmente projetadas enriquecidas em determinados elementos de seqüência repetitiva de DNA presentes no genoma, que possuem diferentes conteúdos médios de GC . Essa abordagem de alta taxa de transferência permite a determinação de, de forma sistemática, quantitativa e orientada por hipóteses, as propriedades relacionadas à seqüência que são importantes para a vinculação de primase e sua atividade enzimática³. Em particular, a ligação importante entre as preferências de encadernação do primase-DNA, (modulada por sequências de DNA flanqueando sítios de ligação de Tri-nucleotídeo específicos) e a processividade de primase foi identificada para este sistema enzimático⁴.

A nova tecnologia foi aplicada para rever a nossa compreensão de sítios de reconhecimento de primase, mesmo para a primase de DNA T7 que tem sido extensivamente estudada⁵. Especificamente, o reexame de conceitos clássicos, tais como sítios de reconhecimento de DNA da primase de DNA T7 (que foram determinados há quase quatro décadas atrás ⁶) usando microarray de ligação de DNA de proteína (PBM) levou a uma visão sem precedentes sobre as características relacionadas com a seqüência de flanquear esses sites de reconhecimento³. Esperava-se que as sequências flanqueando o local de reconhecimento Tri-nucleotídeo de T7 DNA primase (5 ‘-GTC-3 ‘) será aleatório. Em vez disso, descobrimos que sequências de flanqueamento ricas em TG aumentam as chances de a primase do DNA T7 sintetizar primers de RNA mais longos, indicando um aumento na processividade.

Outros métodos que podem ser usados para estudar Propriedades de ligação de DNA de proteínas in vitro incluem o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA)⁷, DNase I footprinting⁸, ressonância de superfície-Plasmon (SPR)⁹, e blotting do sudoeste ¹⁰. These são, entretanto, métodos Low-Throughput somente aplicáveis a investigar um número pequeno de seqüências do ADN. Além disso, a precisão e a sensibilidade de algumas dessas técnicas (por exemplo, EMSA) é baixa. Por outro lado, a seleção in vitro¹¹ é uma técnica que, da mesma forma que a PBM, pode ser utilizada para a identificação de numerosas sequências vinculativas. No entanto, as sequências de baixa afinidade geralmente são excluídas na maioria das aplicações de seleção in vitro; Portanto, essa abordagem não é adequada para a obtenção de dados de vinculação comparativa para todas as seqüências disponíveis. O PBM universal^{1,2é usado} principalmente para caracterizar as especificidades vinculativas dos fatores de transcrição de procariontes e eucariontes, bem como fatores específicos (por exemplo, presença de certos ligantes, cofatores, etc.) que podem afetam essa interação¹².

HTPP expande a aplicação de PBM às enzimas de processamento do ADN combinando o poder estatístico sem precedentes da elevado-produção com a elevada precisão para fornecer a informação no contexto obrigatório da seqüência. Tais dados ainda não foram obtidos para primases e enzimas relacionadas (que têm ligação fraca/transitória ao DNA) devido a limitações técnicas acima mencionadas de outras técnicas disponíveis.