Summary

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

Published: October 08, 2019
doi:

Summary

Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.

Abstract

DNA-Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die die DNA-Synthese von Okazaki-Fragmenten auf dem laggierenden Strang durch DNA-Polymerase während der DNA-Replikation initiieren. Die Bindung von prokaryotischen DnaG-ähnlichen Primasen an die DNA erfolgt in einer bestimmten Trinukleotid-Erkennungssequenz. Es ist ein entscheidender Schritt bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten. Herkömmliche biochemische Werkzeuge, die zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz von DNA-Primase verwendet werden, liefern nur begrenzte Informationen. Anhand eines mikroarraybasierten Bindungstests mit hohem Durchsatz und aufeinander folgenden biochemischen Analysen wurde gezeigt, dass 1) der spezifische Bindungskontext (flankierende Sequenzen der Erkennungsstelle) die Bindungsfestigkeit der DNA-Primase an ihre Schablone beeinflusst. DNA und 2) eine stärkere Bindung von Primase an die DNA ergibt längere RNA-Primer, was auf eine höhere Prozessivität des Enzyms hindeutet. Diese Methode kombiniert PBM und Primase Aktivität Assay und wird als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet, und es ermöglicht die Charakterisierung der spezifischen Sequenzerkennung durch DNA-Primase in beispielloser Zeit und Skalierbarkeit.

Introduction

HTPP nutzt die DNA-bindende Mikroarray-Technologie in Kombination mit biochemischer Analyse (Abbildung 1), um spezifische Merkmale von DNA-Vorlagen, die die enzymatische Aktivität von DNA-Primase beeinflussen, statistisch zu identifizieren. Daher bietet HTPP eine technologische Plattform, die einen Wissenssprung auf diesem Gebiet erleichtert. Die klassischen Werkzeuge, die verwendet werden, um Primase-Erkennungs-Sites zu bestimmen, haben nicht die Fähigkeit, eine riesige Datenmenge zu liefern, während HTPP dies tut.

PBM ist eine Technik, die routinemäßig verwendet wird, um die Bindungspräferenzen von Transkriptionsfaktoren an DNA1,2zu bestimmen; es ist jedoch nicht geeignet, eine schwache/transiente Bindung von Proteinen an die DNA zu erkennen. Im Gegensatz zum universellen PBM, das Informationen über die durchschnittliche Proteinbindungsspezifität zu allen möglichen Sequenzen aus acht Basenpaaren liefert, basiert HTPP auf der Bibliothek einsträngiger DNA-Vorlagen, die einzigartige Sequenzelemente enthalten. Solche DNA-Sequenzelemente umfassen Zehntausende kurze (wenige Dutzend bp) genomische Sequenzen sowie computerisch gestaltete DNA-Sequenzen, die in bestimmten DNA-Wiederholungssequenzelementen angereichert sind, die im Genom vorhanden sind und unterschiedliche durchschnittliche GC-Gehalte aufweisen. . Ein solcher Ansatz mit hohem Durchsatz ermöglicht die systematische, quantitative und hypothesengesteuerte Bestimmung der sequenzbezogenen Eigenschaften, die für die Primasebindung und ihre enzymatische Aktivität wichtig sind3. Insbesondere wurde für dieses enzymatische Systemdiewichtige Verbindung zwischen Primase-DNA-Bindungspräferenzen (moduliert durch DNA-Sequenzen, die bestimmte Trinukleotid-Bindungsstellen flankieren) und der Primase-Prozessivität identifiziert 4 .

Die neue Technologie wurde angewendet, um unser Verständnis von Primase-Erkennungsstellen auch für die T7 DNA Primase zu überprüfen, die ausgiebig untersucht wurde5. Insbesondere die erneute Untersuchung klassischer Konzepte, wie DNA-Erkennungsstellen von T7-DNA-Primase (die vor fast vier Jahrzehnten bestimmt wurden 6) mit Protein-DNA-bindendem Mikroarray (PBM) hat zu beispiellosen Erkenntnissen in Merkmalen geführt, die mit die flankierende Reihenfolge dieser Erkennungsstellen3. Es wurde erwartet, dass die Sequenzen, die die Trinukleotid-Erkennungsstelle von T7 DNA Primase (5′-GTC-3′) flankieren, zufällig sein werden. Stattdessen fanden wir heraus, dass TG-reiche Flankensequenzen die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass T7-DNA-Primse längere RNA-Primer synthetisieren, was auf eine Erhöhung der Prozessivität hindeutet.

Andere Methoden, die verwendet werden können, um DNA-bindende Eigenschaften von Proteinen in vitro zu untersuchen, sind der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstest (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)9und Southwestern Blotting 10. Dabei handelt es sich jedoch um Methoden mit geringem Durchsatz, die nur zur Untersuchung einer kleinen Anzahl von DNA-Sequenzen gelten. Darüber hinaus ist die Genauigkeit und Empfindlichkeit einiger dieser Techniken (z. B. EMSA) gering. Andererseits ist die In-vitro-Auswahl11 eine Technik, die ähnlich wie PBM zur Identifizierung zahlreicher Bindungssequenzen eingesetzt werden kann. Jedoch, niedrige Affinität Sequenzen sind in der Regel in den meisten Anwendungen der In-vitro-Auswahl ausgeschlossen; Daher ist dieser Ansatz nicht geeignet, vergleichende Verbindliche Daten für alle verfügbaren Sequenzen zu erhalten. Das universelle PBM1,2 wird hauptsächlich verwendet, um die Bindungsspezifitäten von Transkriptionsfaktoren von Prokaryoten und Eukaryoten sowie spezifische Faktoren (z. B. Vorhandensein bestimmter Liganden, Kofaktoren usw.) zu charakterisieren, die diese Interaktion beeinflussen12.

HTPP erweitert die PBM-Anwendung auf DNA-verarbeitungsenzyme, indem beispiellose statistische Leistung mit hohem Durchsatz mit hoher Präzision kombiniert wird, um Informationen über den Bindungssequenzkontext bereitzustellen. Solche Daten wurden für Primas und verwandte Enzyme (die eine schwache/transiente Bindung an die DNA haben) aufgrund der oben genannten technischen Beschränkungen anderer verfügbarer Techniken noch nicht gewonnen.

Protocol

1. Design von Mikroarray HINWEIS: DNA-Sonden stellen benutzerdefinierte 36-Nukleotid-Sequenzen dar, die aus der Erkennungsstelle für T7 DNA primase (GTC) bestehen, die sich zwischen zwei variablen Flankenbereichen befindet, gefolgt von einer konstanten 24-Nukleotid-Sequenz, die an einen Glasschlitten gebunden ist3. Wir verwendeten ein 4 x 180.000 Mikroarray-Format, das es ermöglichte, jede DNA-Sequenz in sechs Replikationen zu erkennen, die zufällig auf der Folie verte…

Representative Results

Dieser technologische Fortschritt für die Kartierung der Primase-Bindungsstellen ermöglicht die Erlangung von DNA-Bindungseigenschaften, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar unmöglich zu beobachten sind. Noch wichtiger ist, dass HTPP die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Insbesondere zeigt HTPP neben bekannten 5′-GTC-3′-Erkennungssequenzen verbindliche Spezifitäten auf, was zu Veränderungen der funktionellen Akt…

Discussion

Die PBM-Methode wurde weit verbreitet, um bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und kann auch auf DNA-Verarbeitungsenzyme wie DNA-Primase angewendet werden, die an DNA mit geringer Affinität binden. Es sind jedoch bestimmte Änderungen der Versuchsverfahren erforderlich. Das Mikroarray-Experiment umfasst mehrere Schritte: Entwurf der DNA-Bibliothek, Vorbereitung des Chips, Bindung des Proteinziels, fluoreszierende Kennzeichnung und Scannen. Milde Waschschritte sind entscheidend, da die langen W…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Zuschuss Nr. 1023/18) unterstützt.

Materials

40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

Play Video

Cite This Article
Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

View Video