Alzheimer hastalığının modellenmesi için amiloid-β-salgıcı alginat Mikroboncuk imalatı

7pa2 hücreleri başarıyla aljinat mikrobilyeleri içinde kapsüllenirHazırlık sonrası, üniforma ve küresel aljinat mikroboncuk bu protokol kullanılarak başarıyla oluşturulur. Şekil 2A aşağıda Showcase görüntüleri nasıl bir parametre değiştirme (yani, voltaj) akışı ve aljinat damlacıkları akışı dağılımı değiştirir bir örnek. Şekil 2 B , jelleşme işleminden hemen sonra elde edilen alginat boncukların bir örneğini gösterir. Şekil 2 : İmalat yöntemi optimizasyonu. (A) akış dağılımı değişiklikleri gösteren fotoğraflar. (B) parlak alan görüntü üretim hemen sonra aljinat küresel mikroboncuk gösteren. (C) en iyileştirme adımı örneği: hedef mikro boncuk boyutuna ulaşmak için seçilen imalat parametrelerini ayarlama. Seçilen grafikler, her parametre ile sonuç mikroboncuk boyutu arasındaki ilişkiyi göstermek için (en az n = 100 mikroboncuk boyutu dağılımı). Meme iç çapı, çıkartılan çözelti ve jellenme koşullarının viskozitesi de fabrikasyon boncuk boyutunu etkileyebilir unutmayın. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder. Açıklanan protokol esnektir ve uygulamaya göre bileşiminde değişen aljinat bazlı mikroboncuk farklı boyutlarda imalat sağlar. Şekil 2C’de, HEPES ‘de (pH 7,2)% 2 (w/v) alginat çözeltisi ile 300 μm nozul üzerinden ekstrüze edilen aljinat debisi, voltaj ve frekansın mikroboncuk boyutunda etkisini rapor ediyoruz. Bu çalışmanın kapsamı, sıçan beyni içine gömülebilir mikroboncuk üretmektir, 500-600 μm aralığında ortalama bir mikroboncuk çapı elde etmek için imalat parametrelerini ayarlardık. Kalite kontrol amacıyla, yöntem fabrikasyon boncuk nüfusu (yani, dar boyutu dağılımı) arasında minimal değişkenlik için optimize edilmiştir. Lütfen unutmayın (1) üretilen boncuklar 20 g iğne ile donatılmış bir Hamilton şırınga kullanarak sıçan beyninde enjekte edilebilir; ve (2) sıçan beynin bir yarımküre bu boyutta iki veya üç boncuk kadar barındırabilir. Optimizasyon yapıldıktan sonra, 7PA2 hücrelerini 1,5 x 106 hücre/ml ‘lik bir konsantrasyonda kapsülleme 2% (w/v) alginat ÇÖZELTISI, HEPES ile tamponlu ve 0,5 M kalsiyum klorür jelasyon banyosuna bırakılan istenen mikroboncuklar sağladı. Şekil 3 Aşağıda, standart hücre kültürü koşullarında bir gün sonra mikro boncuklarda eşit olarak dağıtılmış 7PA2 hücrelerinin kapsüllenmiş olduğunu gösterir. 7PA2 hücre proliferasyonu üretici protokolüne göre bir MTS tahlil kullanılarak test edildi. Yedi günlük bir dönemde aljinat ile veya olmadan yetiştirilen 7pa2 hücrelerin davranışı arasında önemli bir fark yoktu (Şekil 3B). Standart kültür koşullarında kapsüllenmiş hücreler kulyatan, hücrelerin deneme süresince çoğalırlar devam etmek bekleniyor, ve hücre kaçış küçük derecelerde bir sonuç olarak beklenebilir, diğer çalışmalar bildirilen gibi28. Bunun etkileri, daha küçük bir hücre yoğunluğuna kapsülleyerek veya mikroboncuk inkübe edilen serum konsantrasyonunu azaltarak hafifletilebilir. Şekil 3 : Kapsüllenmiş 7PA2 hücreler. (A) aljinat mikroboncuk boyunca hücre dağılımı bile gösteren kapsüllenmiş 7PA2 hücrelerin parlak alan görüntüsü. İmalat parametreleri, boncuk başına ~ 150 7PA2 hücre elde etmek için ayarlandı. 7 gün boyunca kültürden alginat boncukların önemli bir varyasyonu görülmemiştir. (B) aljinat olmadan alginat ile inkübe edilen 7PA2 hücrelerinin genel proliferasyonu arasında gözlenen hiçbir fark yoktu. 7pa2 hücreleri büyümek ve aljinat boncuk hacmi arasında göç; Serum konsantrasyonunun azaltılması hücre büyümesini yavaşlatmak için kabul edilebilir. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder. 7pa2 hücrelerini Kapsüller Alginate mikrobilyeleri zaman içinde kararlıElde edilen aljinat mikroboncuk boyutunu ve şeklini araştırmak için imalat ve jelleşme sonrasında mikroskop analizi yapıldı. Seçilen protokol kullanılarak elde edilen mikroboncuk için Ortalama çapı 550 ± 2 μm ‘ dir. Teorik olarak, 550 μm çaplı bir mikroboncuk içinde beklenen hücre sayısı aşağıdaki gibi hesaplanabilir: Burada V = hacim ve r = Radius. Tek bir mikroboncuk hacmi V = 8,8 x 10-5 ml; Bu nedenle, kapsülleme sırasında mikroboncuk başına hücre sayısı = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 hücreler. Deneysel olarak, Biz üretimi hemen sonra kapsüllü hücrelerin sayısını sayılır. Alginat boncukları yavaşça çözünme karışımı ve hücreler tripan mavi solüsyon ile lekelenmiş kullanılarak bozulur. Bir hemokytometer kullanılarak, hücrelerde viability tahmini ve sayım yapıldı; elde edilen sonuçlar, mikroboncuk başına ortalama 116 ± 17 canlı hücre gösterdi (n = 5, veri raporlanmadı). Beklendiği gibi, kapsüllendikten hemen sonra teorik ve deneysel hücre sayısı arasında küçük bir fark görüldü. Bazı uygulamalar için ve özellikle zaman içinde yayımlanan Aβ miktarını belirlemek için, her bir aljinat boncuk kapsüllenmiş hücre sayısını tahmin etmek önemlidir. İlginçtir, kapsülleme işlemi hücre viability üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir. Sonuçlar, kolorektal kanser hücrelerinin (örn. HCT-116) benzer bir yöntem kullanılarak kapsüllendiği önceki bir çalışmayla raporlanır ve 2D kontrolleri20’ ye kıyasla alginat mikroboncuklar içinde hücre canlılığı farklılıkları yoktur. Kapsülleme işleminde kullanılan alginatın kararlılığını ölçmek için, 14 günlük bir süre içinde mikroboncuk çapları ölçülmüştür (n = 100). Kapsüllendikten hemen sonra (veri bildirilmemiş) ile karşılaştırıldığında, kapsülleme işleminden 14 gün sonra ortalama çap cinsinden gözlenen değişiklikler yoktu. Encapsulated 7PA2 hücreler zaman içinde Aβ serbest7PA2 hücrelerinin 2D ve 3D kültürlerinden analiz edilen medya, Aβ1-42 seviyelerinde sürekli bir artış ortaya çıkarır. Hücre kültürü medya her 24 saat örneklenen ve dört gün kadar, ve ELISA kullanılarak analiz edildi. Verilerimiz, Aβ1-42 ‘ in Mikroboncuk (3D) ‘ den serbest bırakılmasından, profilde 2D kültürden çıkan (Şekil 4) benzer olduğunu gösterir. Şekil 4 : 7PA2 hücrelerinden Aβ1-42 salgılanması oranı. (A) 2D ve 3D in vitro modellerinde (4 gün sonra normalleştirilmiş) Aβ sürümü benzer bir profile sahiptir. Her iki model de dört günlük dönemde Aβ düzeylerinde sürekli bir artış göstermektedir ve beklendiği gibi istikrarlı bir konsantrasyona ulaşılmaz. (B) aβ1-42 konsantrasyonu ilk hücre numarasına normalleştirilmiş, zaman içinde Aβ1-42 benzer salgılanmasını gösteren, kültür yöntemleri ne olursa olsun. Ne aljinat varlığı ne de kapsülleme süreci (3D in vitro model) Aβ1-42salgılanmasını değiştirebilir. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder. Kapsüllü 7PA2 hücrelerinin potansiyel uygulamasıBiz, aljinat mikroboncuk kapsüllü 7pa2 hücrelerin etkili Aβ1-42sürekli serbest bırakılması için kullanılabilir ve dolayısıyla herhangi bir preklinik modelde kronik Aβ salgılanması etkisini test etmek için kullanılan rapor. Şekil 5 altında, biz kolayca enjekte edilebilir ve bir sıçan beyni içinde bulunan aljinat mikroboncuk kullanmanın avantajlarını gösterir. Ex vivo bölümler, bir milimetre aljinat boncuk karşı fabrikasyon aljinat mikroboncuk karşılaştırarak, Illustration amaçları için kullanılır. Şekil 5 : İlgili preklinik uygulamalar için mikroboncuk kullanma. Sıçan beynindeki Engraftman için mikroboncuk, beyin parankimatı zarar görmesini önlemek için çok büyük bir lezyon oluşturmadan gömülecek kadar küçük olmalıdır ve normal beyin fonksiyonunu olumsuz yönde etkiler. Görüntü (a) milimetre ölçekli bir boncuk ile mikrometre ölçekli bir parça yan yana arasında bir boyut karşılaştırması gösterir. (B) in vivo amacıyla beyin içinde milimetre ölçekli bir boncuk implante işe yaramazsa. Görüntü (C), bu protokol kullanılarak üretilmiş bir mikro parçası gösterir. Boyutu normal fizyoloji üzerinde zararlı bir etkiye sahip olmadan sıçan Hippocampus içinde eklemek için uygundur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Yukarıdaki görüntüler, bu tür çalışmalar için mikroboncuk boyutunu kontrol etmenin önemini vurgulamaktadır. Burada, 600 μm altında çapların mikroboncuk kullanmanın avantajı göstermektedir. Bu minimal invaziv enjeksiyon kullanımını sağlar (örneğin, Hamilton şırınga) daha iyi beyin içinde enjekte boncuk yerini kontrol etmek. Özetle, 7PA2 hücrelerini kapsülleme mikroboncuk büyüklüğü, kapsüllenmiş hücreler sayısı ve mikroboncuk (örn., konsantrasyon, serbest profil) salgılanan Aβ tahmini sayısını kontrol sağlar. Mikroboncuk boyutunun kontrol edilmesi iki nedenden dolayı önemlidir: 1) serbest bırakılan Aβ konsantrasyonu üzerinde ince ayarlı kontrole izin vermek ve 2) sıçan beynin kontrollü bir bölgede implantasyona izin vermek. Burada elde edilen sonuçlar, aljinat mikroboncukların facile ayarını tarif eder ve daha fazla çalışmalar için potansiyel uygulamaları vurgulamaktadır.