アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

7PA2細胞は、アルギン酸マイクロビーズに正常にカプセル化されています調製後、このプロトコルを用いて均一な球状アルギネートマイクロビーズが正常に生成される。次の図 2Aの画像は、パラメータの 1 つ (電圧) を変更すると、アルギン酸液滴の流れと分散がどのように変化するかの例を示しています。図 2Bは、ゲル化処理直後に得られたアルギネートビーズの一例を示す。 図 2: 製造方法の最適化。(A) 河川分散の変化を示す写真。(B)製造直後のアルギネート球状マイクロビーズを示す明視野画像。(C) 最適化ステップの例:選択した製造パラメータを調整して、目標マイクロビーズサイズを達成する。各パラメータと得られるマイクロビーズのサイズとの関係を示す選択されたグラフ(少なくともn=100マイクロビーズからのサイズ分布)。ノズル内径、吐出液の粘度およびゲル化条件は、製造されたビーズのサイズにも影響を与える可能性があります。エラー バーは S.D. を表し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。 記載されたプロトコルは柔軟であり、アルギン酸ベースのマイクロビーズの異なるサイズの製造を可能にし、用途に応じて組成が変化する。図2Cでは、300μmのノズルを介して押し出されたHEPES(pH 7.2)の2%(w/v)アルギン酸溶液を用いて、マイクロビーズサイズに対するアルギン酸流量、電圧、周波数の影響を報告する。 本研究の範囲は、ラット脳内に埋め込むことができるマイクロビーズを作製することであったので、作製パラメータを調整し、500~600μmの範囲の平均マイクロビーズ径を得た。品質管理の目的のために、この方法は、製造されたビーズの母集団全体の変動を最小限に抑えるために最適化されました(すなわち、狭いサイズ分布)。(1)産生ビーズは、20G針を装備したハミルトン注射器を使用してラットの脳に注入することができることに注意してください。そして(2)ラット脳の1つの半球は、このサイズの2つまたは3つのビーズをホストすることができます。 最適化後、HEPESで緩衝した2%(w/v)アルギン酸溶液に懸濁した1.5 x 106細胞/mLの濃度で7PA2細胞を封入し、0.5M塩化カルシウムゲル化浴に投下し、所望のマイクロビーズを得た。図 3以下は、標準的な細胞培養条件で1日後にマイクロビーズに均等に分布するカプセル化された7PA2細胞を示す。7PA2細胞増殖は、製造元のプロトコルに従ってMTSアッセイを用いて試験した。7日間のアルギネートの有無にかかわらず増殖した7PA2細胞の挙動には有意差はなかった(図3B)。カプセル化された細胞を標準的な培養条件でインキュベートする場合、細胞は実験の期間中にわたって増殖し続けると予想され、その結果、細胞脱出の小さな程度が期待され、他の作品28で報告される。この効果は、より小さな細胞密度でカプセル化するか、マイクロビーズがインキュベートされる血清濃度を低下することによって軽減することができる。 図 3:カプセル化された7PA2細胞。(A)アルギネートマイクロビーズ全体の細胞分布も示す封入された7PA2細胞の明視野画像。製造パラメータは、ビーズあたり〜150 7PA2細胞を得るように設定した。7日間の培養においてアルギン酸ビーズに有意な変動は認められなかった。(B)アルギン酸を用いてインキュベートした7PA2細胞の全体的増殖とアルギン酸を用いずにインキュベートした細胞との間に差は認められなかった。7PA2細胞は、アルギネートビーズの体積を横切って成長し、移動します。血清濃度の低下は、細胞の増殖を遅くすると考えることができる。エラー バーは S.D. を表し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。 7PA2細胞を封入するアルジン化マイクロビーズは、時間の経過とともに安定しています得られたアルジン酸マイクロビーズの大きさや形状を調べるために、製造・ゲル化後に顕微鏡分析を行った。選択されたプロトコルを使用して得られたマイクロビーズの平均直径は550±2 μmである。 理論的には、直径550μmのマイクロビーズで期待される細胞数は、次のように計算できます。 ここで、V = ボリュームとr = 半径。単一のマイクロビーズの体積はV = 8.8 x 10-5 mLです。したがって、封入時のマイクロビーズ当たりの細胞数= (1.5 × 106)x (8.8 x 10-5)≥ 130 セル。 実験的に、製造直後に封入細胞の数を数えた。アルギネートビーズを溶解ミックスを用いて穏やかに破壊し、細胞をトリパンブルー溶液で染色した。細胞の生存率推定および計数は、血球計を用いて行った。得られた結果は、マイクロビーズあたり平均116±17の生細胞を示した(n =5、データは報告されていない)。予想通り、カプセル化直後の理論細胞数と実験細胞数のわずかな差が認められた。一部の用途では、特に時間の経過とともに放出されたAβの量を決定するためには、各アルギン酸ビーズに封入された細胞の数を予測することが重要である。 興味深いことに、カプセル化プロセスは細胞の生存率に大きな影響を与えません。結果は、大腸癌細胞(すなわち、HCT-116)が同様の方法を用いてカプセル化された前の研究で報告され、2D対照20と比較してアルギン酸マイクロビーズにおける細胞生存率に差はない。 封入プロセスで使用されるアルギン酸塩の安定性を測定するために、14日間(n=100)にわたってマイクロビーズ径を測定しました。カプセル化直後と比較して、カプセル化後14日目の平均直径の変化は観測されなかった(データは報告されていない)。 カプセル化された7PA2細胞は、時間の経過とともにAβを放出する7PA2細胞の2Dおよび3D培養物から分析された条件付き培養培養物は、Aβ1-42レベルの一定の増加を明らかにする。細胞培養培養培養を24時間毎にサンプリングし、最大4日間、ELISAを用いて分析した。我々のデータは、マイクロビーズ(3D)からのAβ1-42の放出速度が2D培養から放出されるプロファイルと類似していることを示している(図4)。 図 4:7PA2細胞からのAβ1-42分泌率。(A) Aβ放出(4日後に正常化した%)インビトロモデルの2Dおよび3Dモデルは、同様のプロファイルを有する。両方のモデルは、4日間にわたってAβレベルの一定の増加を示し、予想通り、安定した濃度に達していない。(B)Aβ1-42の濃度は初期細胞数に正規化され、培養方法にかかわらず経時にAβ1〜42の同様の分泌を示す。 アルギン酸塩の存在もカプセル化のプロセス(3Dインビトロモデル)もAβ1-42の分泌を変えない。エラー バーは S.D. を表し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。 カプセル化された7PA2細胞の潜在的応用我々は、アルギン酸マイクロビーズに封入された7PA2細胞がAβ1-42の持続放出に有効に使用できることを報告し、したがって、任意の前臨床モデルにおける慢性Aβ分泌の効果を試験するために使用される。図5では、ラットの脳内に容易に注入して配置できるアルギン酸マイクロビーズを用いる利点を示す。Ex vivoセクションは、ミリメートルのアルギネートビーズと製造されたアルジン酸マイクロビーズを比較する、イラストレーションの目的で使用されます。 図 5: 関連する前臨床アプリケーションにマイクロビーズを使用する。ラット脳の生着のためのマイクロビーズは、脳の変性に損傷を避け、正常な脳機能に悪影響を与えるために大きすぎる病変を作成せずに埋め込まれるのに十分小さくなければなりません。画像(A)は、ミリメートルスケールのビーズとマイクロメートルスケールのビーズを並べてサイズ比較した結果を示しています。(B) 生体内でミリメートルスケールのビーズを脳内に埋め込むとはうまくいかない。画像(C)は、このプロトコルを用いて製造されたマイクロビーズを示す。サイズは、正常な生理学に有害な影響を与えることなく、ラットの海馬内への挿入に適しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 上の画像は、このような研究のためのマイクロビーズのサイズを制御することの重要性を強調しています。ここでは、直径600μm以下のマイクロビーズを用いる利点を実証する。これにより、最小限に侵襲的な注射(例えば、ハミルトン注射器)を使用して、脳内の注入されたビーズの位置をより良く制御することができます。 要約すると、7PA2細胞をカプセル化すると、マイクロビーズのサイズ、カプセル化された細胞の数およびマイクロビーズから分泌されるAβの予測(例えば、濃度、放出プロファイル)を制御できます。マイクロビーズのサイズを制御することは、2つの理由から不可欠です:1)放出されたAβの濃度を微調整制御を可能にし、2)ラット脳の制御された領域に移植を可能にする。ここで得られた結果は、アルギネートマイクロビーズの顔のチューニングを記述し、さらなる研究のための潜在的な応用を強調する。