Qui, presentiamo istruzioni dettagliate su come costruire e calibrare i ceptometri di qualità della ricerca (sensori di luce che integrano l’intensità della luce su molti sensori disposti linearemente lungo una barra orizzontale).
La ceptometria è una tecnica utilizzata per misurare la trasmittanza di radiazioni fotosinteticamente attive attraverso una tettoia vegetale utilizzando più sensori di luce collegati in parallelo su una barra lunga. La ceptometria è spesso utilizzata per dedurre le proprietà della struttura della tettoia e dell’intercettazione della luce, in particolare l’indice di area delle foglie (LAI) e l’indice di area vegetale efficace (PAIeff). A causa del costo elevato dei ceptometri disponibili in commercio, il numero di misurazioni che possono essere prese è spesso limitato nello spazio e nel tempo. Ciò limita l’utilità della ceptometria per lo studio della variabilità genetica nell’intercettazione della luce e preclude l’analisi approfondita e la correzione dei pregiudizi che possono inclinare le misurazioni a seconda dell’ora del giorno. Abbiamo sviluppato continuamente la registrazione di ceptometri (chiamati PARbars) che possono essere prodotte per USD $75 ciascuno e produrre dati di alta qualità comparabili alle alternative disponibili in commercio. Qui forniamo istruzioni dettagliate su come costruire e calibrare PARbars, come distribuirli nel campo e come stimare PAI da dati di trasmittanza raccolti. Forniamo risultati rappresentativi da tettine di grano e discutiamo ulteriori considerazioni che dovrebbero essere fatte quando si utilizzano PARbars.
I ceptometri (matrici lineari di sensori di luce) vengono utilizzati per misurare la proporzione di radiazioni fotosinteticamente attive intercettate da tettine di piante. I ceptometri sono ampiamente utilizzati per la ricerca sulle colture agricole a causa della natura relativamente semplice delle misurazioni e della semplicità di interpretazione dei dati. Il principio di base della ceptometria è che la trasmittanza della luce alla base di una tettoia vegetale (τ) dipende dall’area proiettata dei materiali che assorbono la luce sopra. Le misurazioni di PAR sopra e sotto la tettoia possono quindi essere utilizzate per stimare tratti di tettuccio come l’indice dell’area delle foglie (LAI) e l’indice di area vegetale efficace (PAIeff) (che comprende steli, culmi e strutture riproduttive oltre alle foglie)1 ,2,3. L’affidabilità delle stime di PAIeff dedotte da τ è migliorata modellando gli effetti della frazione di fascio del par in entrata (fb), l’assorbanza delle foglie (a) e il coefficiente di estinzione efficace della tettoia (K ); K, a sua volta, dipende sia l’angolo di Zenith solare(θ) e la distribuzione dell’angolo di foglia (χ)1,4,5,6. È una pratica comune correggere per questi effetti. Tuttavia, ci sono altri pregiudizi che non hanno ricevuto la dovuta considerazione in passato a causa di limitazioni metodologiche e di costo.
Recentemente abbiamo identificato un significativo bias dipendente dal tempo nelle misurazioni istantanee della ceptometria delle colture di fila, come grano e orzo7. Questa polarizzazione è causata da un’interazione tra l’orientamento di piantagione di fila e l’angolo di Zenith solare. Per superare questa polarizzazione, i ceptometer in continuo Logging possono essere montati sul campo per monitorare i cicli diurni di intercettazione della luce della tettoia e quindi calcolare le medie giornaliere di τ e Paieff . Tuttavia, le misurazioni continue sono spesso inrealizzabili a causa del costo proibitivo dei ceptometri disponibili in commercio – spesso diverse migliaia di dollari USA per un singolo strumento – e il requisito per le misurazioni di molte trame di campo. Quest’ultimo è particolarmente evidente nell’era-omica in cui sono necessarie molte centinaia di genotipi per le analisi genomiche, come gli studi di associazione a livello di genoma (GWAS) e la selezione genomica (GS) (per la revisione vedere Huang & Han, 20148). Abbiamo riconosciuto la necessità di un ceptometri economicamente vantaggioso che potesse essere prodotto in grandi quantità e di essere utilizzato per misurazioni continue su molti genotipi.
Come soluzione, abbiamo progettato dei ceptometri (PARbars) facili da costruire e ad alta precisione al costo di $75 USD per unità e richiedendo circa un’ora di lavoro da costruire. I PARbars sono costruiti utilizzando 50 fotodiodi che sono sensibili solo nella banda PAR (lunghezze d’onda 390 – 700 nm), con poca sensibilità al di fuori di questa gamma, eliminando l’uso di costosi filtri. I fotodiodi sono collegati in parallelo su una lunghezza di 1 m per produrre un segnale di tensione differenziale integrato che può essere registrato con un datalogger. La circuiteria è rivestita in resina epossidica per l’impermeabilizzazione e i sensori operano su un ampio intervallo di temperatura (-40 a + 80 ° c), permettendo ai PARbars di essere distribuiti sul campo per lunghi periodi di tempo. Con l’eccezione dei fotodiodi e un resistore a basso coefficiente di temperatura, tutte le parti necessarie per costruire un PARbar possono essere acquistate da un negozio di ferramenta. Nella tabella dei materialiviene fornito un elenco completo delle parti e degli strumenti necessari. Qui presentiamo le istruzioni dettagliate su come costruire e utilizzare PARbars per la stima di PAIeff e presentare i risultati rappresentativi da tettine di grano.
La corretta attuazione del protocollo delineato qui per i ceptometri di costruzione (PARbars) dipende in modo più sensibile su due fasi: 1,5 (incollaggio fotodiodi in posizione) e 1,6 (fotodiodi saldanti al filo di rame). Passo 1,5 è incline all’errore allineando i fotodiodi in modo non corretto rispetto alla loro polarità intrinseca. Per i fotodiodi che abbiamo usato, e che si consiglia come elementi specifici essenziali, la polarità è identificata in virtù delle due linguette del connettore elettrico sul diodo aventi dimensioni chiaramente diverse. Quindi, prima di applicare la colla cianoacrilato e saldare i fotodiodi in posizione, si consiglia vivamente di controllare che tutti i diodi siano posizionati con le grandi linguette di collegamento che si affacciano in una direzione e le piccole linguette che si affacciano nell’altra direzione. Passo 1,6 è incline al fallimento a causa di scarsa tecnica di saldatura e la formazione di una giunzione saldata a freddo. Questo può essere evitato applicando il flusso di saldatura sottile utilizzando una penna di flusso immediatamente prima della saldatura e assicurando che sia il filo e la scheda fotodiodo sono riscaldati con la punta di saldatura (a circa 350-400 oC) prima di saldare stesso viene applicato al bivio. I problemi con i collegamenti elettrici in un PARbar tipicamente si manifestano sotto forma di una pendenza di calibrazione nettamente diversa da quelle di altri PARbars. Tali problemi possono essere catturati in anticipo testando ogni collegamento elettrico durante la costruzione (come descritto al passo 1,6), e di nuovo dopo che tutti i collegamenti sono stati saldati, ma prima che siano stati chiusi in resina epossidica (passo 1,9). Una terza fonte potenziale di errore deriva dal mancato utilizzo di un resistore di precisione a basso coefficiente di temperatura, la cui resistenza è insensibile alla temperatura; utilizzando un resistore ordinario causerà l’errore come la resistenza, e quindi l’uscita di tensione per unità di luce assorbita dai diodi, cambia con la temperatura ambiente. La principale fonte di errore finale non è univoca per le PARbars, ma si applica a tutte le misurazioni della ceptometria: l’inferenza di un indice di area vegetale efficace o di un indice dell’area delle foglie dalla cattura della luce dipende dalle caratteristiche della struttura del baldacchino (in particolare l’assorbanza delle foglie e distribuzione dell’angolo di foglia; a e c in eqns 1 e 2) che possono variare durante lo sviluppo vegetale e tra i genotipi.
Ci sono due aree principali in cui il protocollo qui descritto potrebbe essere modificato o adattato. In primo luogo, i PARbars che presentiamo qui sono stati progettati specificamente per l’uso in colture di fila, come il grano e l’orzo, ma il design potrebbe essere facilmente modificato per altre applicazioni. Ad esempio, un resistore shunt con maggiore resistenza potrebbe essere utilizzato per migliorare il guadagno (uscita mV per unità PAR) a intervalli di PAR inferiori. Per la versatilità, un potenziometro di precisione a coefficiente di bassa temperatura (resistore variabile) potrebbe essere utilizzato per modificare la gamma di sensibilità del PARbar in base alle esigenze o per apportare piccole regolazioni per guadagnare in modo che ognuna di molte PARbars abbia piste di calibrazione identiche. In secondo luogo, i fotodiodi potrebbero anche essere utilizzati singolarmente come sensori quantistici, permettendo all’utente di catturare la variazione spaziale e temporale all’interno di tettine individuali per un costo molto inferiore a quello possibile utilizzando sensori quantistici disponibili in commercio. Questo potrebbe essere particolarmente prezioso dato il crescente interesse per la fotosintesi dinamica in condizioni di luce fluttuante12. In terzo luogo, anche se abbiamo utilizzato un datalogger convenzionale (e costoso) per i dati presentati in questo studio, è possibile che i datalogger siano costruiti utilizzando componenti di base pronti all’uso, consentendo la creazione di un sistema combinato di ceptometria e datalogger su un bilancio limitato. La popolarità delle cosiddette piattaforme Maker, come Arduino e Raspberry Pi, offrono grande promessa in questo settore; suggeriamo il progetto open source di Cave Pearl, basato su Arduino,13 come antipasto per un ulteriore sviluppo. I datalogger Cave Pearl sono stati progettati per il monitoraggio ambientale degli ecosistemi delle grotte, quindi la robustezza e la scarsa domanda di energia sono state considerazioni fondamentali nel loro design. Considerazioni analoghe sono rilevanti per l’attuazione del lavoro di fenotipizzazione vegetale. I componenti del datalogger Cave Pearl sono poco costosi (meno di $50 USD per unità) e piccoli, che potrebbero consentire loro di essere incorporati direttamente nei PARbars.
L’applicazione dei PARbars qui descritti affronta tre limitazioni principali. In primo luogo, l’inferenza dell’indice dell’area vegetale o dell’indice dell’area delle foglie dalla cattura della luce misurata è ostacolata da forti distorsioni dipendenti dal tempo, in particolare nelle colture di fila7. Questo può essere superato effettuando misurazioni ripetute o continue in un giorno. Secondo, i fotodiodi economici non hanno un’uscita spettrale che è esattamente proporzionale al flusso del Foton (la variabile di maggiore interesse nella ricerca sulla fotosintesi). Ciò può causare pregiudizi quando la qualità della luce cambia notevolmente attraverso una tettoia, anche se le stime precedenti dell’errore risultante indicano che è nell’ordine di qualche percentuale7. In terzo luogo, i PARbars non possono distinguere tra la trave diretta e i componenti diffusi della PAR in entrata sopra la tettoia. Poiché la radiazione diffusa penetra più in profondità nel baldacchino rispetto alla luce solare diretta14, la trasmittanza sarà aumentata e il Paieff sarà sottovalutato Man mano che la frazione diffusa dell’irradianza totale aumenta. Quando tutte le radiazioni sono diffuse, PAIeff è direttamente proporzionale al logaritmo di 1/τ piuttosto che alla relazione mostrata nell’equazione 115. Cruse et al. (2015) 16 notato che gli strumenti commerciali attualmente disponibili che possono misurare la par diretta e diffusa sono costosi e richiedono una manutenzione regolare, così hanno progettato un apparato semplice ed economico per affrontare questo problema. Il loro sistema è costituito da un sensore quantistico che viene regolarmente ombreggiato da un gruppo di shadowband motorizzato e mobile e consente la misurazione continua del PAR totale, diretto e diffuso. Il sensore utilizzato nel Cruse et al. 16 sistema potrebbe essere sostituito con lo stesso fotodiodo utilizzato in parbars per ridurre ulteriormente i costi e può essere facilmente incorporato nella configurazione Parbar esistente. Queste misurazioni potrebbero essere integrate nella pipeline di elaborazione dei dati e migliorerebbero ulteriormente l’affidabilità delle stime di PAIeff.
Il vantaggio principale di PARbars rispetto ai ceptometri commerciali esistenti è il loro basso costo, che rende possibile produrli in grandi quantità. Recentemente, c’è stato un crescente interesse per le nuove tecnologie di fenotipizzazione vegetale ad alto rendimento per la stima dei tratti di baldacchino (per la revisione Vedi Yang et al., 201717). Mentre questi metodi sono promettenti in quanto producono enormi quantità di dati sono tipicamente molto indiretti e richiedono la convalida contro le tecniche convenzionali. Le PARbars potrebbero fungere da strumento di convalida basato sui costi e a terra per queste nuove tecniche.
Il basso costo di produzione dei PARbars li rende anche un’opzione praticabile per le misurazioni continue sul campo. Questo potrebbe essere utile per diversi motivi. Ad esempio, le misurazioni continue possono essere utilizzate per caratterizzare i bias di orientamento delle righe per sviluppare funzioni di correzione specifiche per il tempo per le misurazioni istantanee (per ulteriori informazioni vedere Salter et al. 20187). La ceptometria continua può anche catturare brevi fluttuazioni nella cattura della luce del baldacchino nel tempo (macchie solari e macchie) causate da nuvole che passano in testa, movimento della tettoia, ecc. La fotosintesi è nota per essere molto sensibile ai piccoli cambiamenti nelle condizioni ambientali e i cambiamenti “dinamici” nella fotosintesi sono ora pensati per essere importanti nella resa delle colture (per la revisione Vedi Murchie et al., 201812). Le PARbars installate sul campo con un intervallo di registrazione opportunamente breve potrebbero essere utilizzate per catturare queste brevi fluttuazioni e fornire una migliore comprensione della natura dinamica delle tettine vegetali.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Richard Richards e il dottor shek Hossain a CSIRO, agricoltura e cibo per l’accesso e la gestione delle trame di campo utilizzate per questa ricerca. Questa ricerca è stata sostenuta dal partenariato internazionale sulla resa del grano, attraverso una sovvenzione fornita dalla società di ricerca e sviluppo dei cereali (US00082). TNB è stato sostenuto dal Consiglio australiano della ricerca (DP150103863 e LP130100183) e dalla National Science Foundation (premio #1557906). Questo lavoro è stato sostenuto dall’Istituto nazionale USDA per l’alimentazione e l’agricoltura, i progetti Hatch 1016439 e 1001480.
1.5 Ω low temperature coefficient precision resistor | TE Connectivity Ltd., Schaffhausen, Switzerland. | UPW25 series | Could be made using multiple larger resistors in parallel but they need to have low temperature coefficient (i.e. ± 3 ppm/°C). URL for commercial source: https://bit.ly/2DFuPpm |
Acrylic diffuser | Plastix Australia Pty. Ltd., Arncliffe, NSW, Australia. | 445 – Opal White | 1200 mm length x 30 mm width x 4.5 mm thick. URL for commercial source: https://bit.ly/2Bq0fyc |
Aluminum U-bar | Capral Ltd., Bundamba, QLD, Australia. | EK9160 | 1220 mm length x 35 mm width x 25 mm depth. URL for commercial source: https://bit.ly/2PPfJou |
Bare solid core copper wire | Non-specific part | ||
Bolts | Non-specific part | ||
Clamps | Non-specific part | ||
Clear epoxy potting resin | Solid Solutions, East Bentleigh, VIC, Australia. | 651 – Universal Epoxy Potting Resin | Clear epoxy resin for electrical applications. URL for commercial source: https://bit.ly/2qY0pHa |
Cyanoacrylate glue | Non-specific part | ||
Datalogger | Campbell Scientific, Logan, Utah, USA. | CR5000 | Other dataloggers that record differential voltages could be used. URL for commercial source: https://bit.ly/2U7Io5H |
Drill or drill press | Non-specific part | ||
Glue lined heat shrink | Non-specific part | ||
Heat gun | Non-specific part | ||
LED torch | Non-specific part | ||
Masking tape | Non-specific part | ||
Photodiodes (50) | Everlight Americas Inc., Carrollton, Texas, USA. | EAALSDSY6444A | It is important that this specific component is used due to spectral response. URL for commercial source: https://bit.ly/2FzVnuH |
Polyurethane foam filler | Non-specific part | ||
Quantum sensor | LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA. | LI-190R | For calibration of PARbars only. URL for commercial source: https://bit.ly/2HEfKbh |
Screwdrivers | Non-specific part | ||
Silicone sealant | Non-specific part | ||
Solder | Non-specific part | ||
Solder flux pen | Non-specific part | ||
Soldering iron | Non-specific part | ||
Spirit/bubble level | Non-specific part | ||
Tap and die set | Non-specific part | ||
Two-core cable | Non-specific part | ||
Voltmeter | Non-specific part | ||
Waterproof connectors | Core Electronics, Adamstown, NSW, Australia. | ADA743 | 2 core waterproof connector. DC power connectors work well. URL for commercial source: https://bit.ly/2Brcrik |