Summary

Lipidómica y Transcriptómica en Enfermedades Neurológicas

Published: March 18, 2022
doi:

Summary

Este artículo presenta un protocolo modular para lipidómica tisular y transcriptómica, y lipidómica plasmática en modelos de ratones de enfermedades neurológicas dirigidos a lípidos subyacentes a la inflamación subyacente y la actividad neuronal, lípidos de membrana, mensajeros aguas abajo y enzimas / receptores subyacentes de ARNm función lipídica subyacente. Se describen los procedimientos de muestreo, procesamiento de muestras, extracción y cuantificación.

Abstract

Los lípidos sirven como la interfaz principal para los insultos cerebrales o estímulos conducentes a enfermedades neurológicas y son un reservorio para la síntesis de lípidos con diversas funciones de señalización o ligando que pueden subrayar la aparición y progresión de enfermedades. A menudo cambiando a nivel presintomático, los lípidos son una fuente emergente de dianas farmacológicas y biomarcadores. Muchas enfermedades neurológicas exhiben neuroinflamación, neurodegeneración y excitabilidad neuronal como características comunes, parcialmente moduladas por sistemas específicos de señalización lipídica. La interdependencia e interrelación de la síntesis de varios lípidos provoca un análisis multilipídico, multienzimático y multirreceptor para derivar los puntos en común y las especificidades de los contextos neurológicos y acelerar el desentrañamiento de los aspectos mecanicistas del inicio y la progresión de la enfermedad. La atribución de roles lipídicos a distintas regiones del cerebro avanza en la determinación del fenotipo molecular lipídico y la morfología asociada con una enfermedad neurológica.

Aquí se presenta un protocolo modular adecuado para el análisis de lípidos de membrana y señales lipídicas aguas abajo junto con ARNm de enzimas y mediadores subyacentes a su funcionalidad, extraídos de regiones cerebrales discretas que son relevantes para una enfermedad neurológica y / o condición en particular. Para garantizar un perfil lipidómico comparativo preciso, los flujos de trabajo y los criterios operativos se optimizaron y estandarizaron para: i) muestreo cerebral y disección de regiones de interés, ii) coextracción de múltiples señales lipídicas y lípidos de membrana, iii) extracción dual de lípidos / ARNm, iv) cuantificación por cromatografía líquida monitoreo de reacciones múltiples (LC / MRM) y v) perfil estándar de ARNm. Este flujo de trabajo es susceptible de las bajas cantidades de tejido obtenidas mediante el muestreo de las subregiones cerebrales funcionalmente discretas (es decir, mediante punzonado cerebral), evitando así el sesgo en el análisis multimolecular debido a la heterogeneidad del tejido y / o la variabilidad animal. Para revelar las consecuencias periféricas de las enfermedades neurológicas y establecer lecturas moleculares traslacionales de los estados de enfermedad neurológica, también se persiguen y describen el muestreo de órganos periféricos, el procesamiento y su posterior análisis lipidómico, así como la lipidómica plasmática. El protocolo se demuestra en un modelo de ratón con epilepsia aguda.

Introduction

Los recientes avances en la función de los lípidos y su papel en la aparición y progresión de enfermedades neurológicas abren nuevos lugares de investigación y desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y elucidación del mecanismo de la enfermedad1. Las diferencias documentadas en la composición de lípidos en diferentes regiones del cerebro, enfatizadas por las técnicas modernas de imágenes moleculares, como las imágenes de espectrometría de masas y el perfil avanzado de espectrometría de masas, cambian el paradigma de la investigación de lípidos de todo el cerebro hacia regiones cerebrales funcionalmente distintas y discretas. El hecho de que la composición lipídica varíe en diferentes regiones del cerebro provoca una nueva conceptualización tanto de la sensibilidad a los lípidos de la membrana como de la señalización lipídica aguas abajo en respuesta a un insulto o estímulo cerebral a través de las regiones cerebrales funcionalmente distintas. Por lo tanto, los protocolos de lípidos requieren nuevos desarrollos para abordar el desafío de las bajas cantidades de tejido para una detección y cuantificación de mayor resolución espacial y, al mismo tiempo, el análisis de múltiples componentes lipídicos de las membranas celulares y las vías de señalización. Además, la determinación de enzimas, ligandos lipídicos y receptores implicados en la regulación de sus niveles y función es primordial para dilucidar las vías de señalización afectadas en una enfermedad neurológica y guiar nuevas investigaciones mecanicistas en un contexto fisiopatológico.

Además del aumento de la resolución espacial cerebral, hay dos dificultades principales que desafían el desarrollo de nuevos enfoques neurolipidómicos. En primer lugar, las moléculas de señalización lipídica son típicamente de muy baja abundancia en comparación con los lípidos constitutivos de membrana. En segundo lugar, el lipidoma exhibe una alta heterogeneidad estructural, difícil de diseccionar utilizando un único enfoque analítico. Por lo tanto, los métodos de extracción y análisis se adaptan a diferentes categorías de lípidos y se realizan comúnmente en distintas muestras de tejido.2. Métodos lipidómicos de escopeta3 son excelentes herramientas para revelar rápidamente un amplio perfil de lípidos de membrana, mientras que el aumento de la sensibilidad y la selectividad ofrecidas por los métodos espectrométricos de masas de descubrimiento y cuantificación dirigidos se aprovechan para la investigación de lípidos de señalización de baja abundancia, incluidos: i) lípidos inflamatorios y ii) lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como endocannabinoides (eCB), lípidos vinculados a aminoácidos, etc.4,5. Para abarcar los cambios lipídicos tanto a nivel de membrana celular como de señalización que ocurren en las regiones cerebrales de los modelos de enfermedades neurológicas, generalmente la extracción y el análisis de lípidos se llevan a cabo en distintas muestras de tejido, obtenidas de distintos lotes de animales o de diferentes hemisferios, o diseccionando una región de tejido más grande en múltiples piezas. Cuando los niveles de ARNm de los receptores enzimáticos también son de interés, su investigación generalmente requiere la obtención de una muestra de tejido distinta. Por ejemplo, la investigación de lípidos de membrana, cannabinoides endógenos y ARNm requeriría tres muestras de tejido diferentes (por ejemplo, dos muestras para los dos métodos de extracción de lípidos -lípidos de membrana y lípidos de señalización- y dos métodos posteriores de análisis de lípidos- y una muestra para el análisis de ARNm). La investigación de lípidos inflamatorios y cannabinoides endógenos requiere dos muestras de tejido distintas, métodos de extracción y métodos de análisis, respectivamente. Otro ejemplo es la investigación del ARNm y de cualquier categoría de lípidos en una muestra de punzón cerebral o microdisección láser que, en consecuencia, requiere que dos animales distintos obtengan dos muestras por (sub)región cerebral. En tales casos se produce con frecuencia un grado sustancial de variabilidad y/o escasa reproducibilidad de los resultados, originándose en la variabilidad biológica y/o la heterogeneidad tisular. Guiados por estas limitaciones prácticas del análisis multimolecular, que ocurren particularmente a alta resolución espacial en el cerebro, se diseñó un protocolo neurolipidómico de tres módulos que abarca: 1) coextracción y coanálisis por LC / MRM de lípidos inflamatorios (por ejemplo, eicosanoides (eiCs)) y lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como eCBs2; 2) co-extracción de fosfolípidos (PL) y eCB con posterior análisis multiescanal LC/MRM y precursor/neutral de pérdida2; y 3) extracción dual de (fosfo)lípidos de membrana y eCBs, así como ARNm, con posterior análisis de secuenciación LC/MRM y qPCR o ARN6. Dependiendo de la cuestión biológica a abordar en una enfermedad neurológica y la región cerebral de interés, se puede aplicar una combinación del primer y segundo protocolo, o el primer y el tercer protocolo, en la misma muestra de tejido para tejidos que pesan alrededor de 4 mg. El primer y tercer protocolo se pueden aplicar de forma independiente para tejidos de alrededor de 2 mg. El segundo protocolo se puede aplicar para tejidos que pesan tan poco como 0,5 mg. Independientemente del módulo de protocolo neurolipidómico seleccionado, el muestreo de tejido y el procesamiento preanalítico, el aislamiento cerebral y la disección de la región, así como el procedimiento para sacrificar el modelo animal están estandarizados e idénticos para los tres módulos del protocolo. En nuestra investigación de enfermedades neurológicas, los órganos periféricos que son relevantes para las consecuencias patológicas de la enfermedad siempre se recopilan y analizan utilizando estos protocolos modulares. Además, la sangre se muestrea regularmente para lipidómica plasmática para servir como una herramienta de lectura de enfermedades neurológicas con vistas a posibles aplicaciones traslacionales. El protocolo de lipidómica modular aquí presentado es muy versátil: escalable a cantidades de tejido más grandes y fácilmente aplicable para prácticamente cualquier tipo de tejido y enfermedad. Para la aplicación del protocolo modular (Figura 1) en las enfermedades neurológicas, cualquier modelo estandarizado de roedores de inicio y progresión de trastornos neurológicos, como la lesión cerebral traumática, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la epilepsia son susceptibles.

Estos protocolos se han aplicado ampliamente para estudiar los cambios en el lipidoma tisular y/o el transcriptoma en la fase aguda de la epilepsia en el modelo de epilepsia inducida por ácido kínico (KA)2,7, modelo ampliamente utilizado en estudios preclínicos debido a la semejanza con la epilepsia del lóbulo temporal humano (TLE)8,9,10,11. Utilizando estos protocolos, se evaluó el potencial terapéutico de fármacos como la Palmitoiletanolamida (PEA)12,13 en el mismo modelo de ratón de epilepsia. El estudio identificó cambios en los lípidos y el ARNm a alta y baja resolución espacial en el cerebro y la periferia, en el punto temporal de las intensidades máximas de convulsiones agudas (a los 60 minutos de inducción posterior a la incautación) y en el tratamiento subcrónico y agudo con PEA en cuatro puntos de tiempo diferentes (20, 60, 120 y 180 min) después de la inducción de la convulsión ka, una ventana de tiempo que cubre la fase aguda de la epilepsia. El plasma, los cerebros y los órganos periféricos de ratones no tratados inyectados con KA, ratones tratados con PEA aguda y subcrónicamente, así como ratones de control de vehículos y vehículos PEA, se recolectaron en cada punto de tiempo12,13 y se investigaron con este análisis molecular. Los datos moleculares se correlacionaron con fenotipos conductuales obtenidos por puntuación de convulsiones, así como con datos derivados de inmunohistoquímica sobre procesos neurodegenerativos, con el fin de desentrañar la progresión de la fase de epilepsia aguda y el potencial de la PEA para aliviarla.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí están de acuerdo con la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63UE) y fueron aprobados por el comité local de animales del estado de Renania-Palatinado, Alemania (referencia de archivo: 23 177-07/G16-1-075). 1. Modelo animal de epilepsia aguda y inducida por KA tratada profilácticamente Realizar la inducción de convulsiones, el tratamiento y la puntuación del comportamiento. <li…

Representative Results

El conjunto de protocolos descritos puede combinarse en diferentes niveles de una manera específica para cada objetivo, como la elección del modelo animal, la ruta de muestreo, el método de extracción y la elaboración de perfiles (Figura 1). Con el fin de determinar los cambios en el nivel de lípidos en el cerebro y la periferia a lo largo de un curso de tiempo de un estado de crisis epilépti…

Discussion

La metodología neurolipidómica y transcriptómica descrita aquí es un medio viable para investigar cualquier enfermedad o desarrollo saludable a alta y baja resolución espacial en el cerebro y los órganos periféricos. Debido a los procedimientos optimizados de muestreo y manejo de plasma, el análisis lipidómico plasmático también se puede llevar a cabo a partir de los mismos animales sacrificados para lipidómica tisular y transcriptómica, mejorando así la confiabilidad de los correlatos moleculares de la san…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dedicamos este artículo a la Dra. Ermelinda Lomazzo. Durante la finalización de este manuscrito, la Dra. Ermelinda Lomazzo falleció. Ella es la encarnación de la pasión por la ciencia y el compromiso desinteresado en el trabajo en equipo para cumplir un propósito de investigación significativo. Ella siempre soñó con contribuir significativamente al mayor bienestar de los humanos. Su naturaleza de buen corazón nunca se vio comprometida por los caminos extenuantes de la ciencia y la vida. Ella permanecerá invaluable, y para siempre, en nuestros corazones.

Julia M. Post fue financiada por el Programa Focus para la Neurociencia Traslacional (FTN) en el Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia y actualmente está financiada por el proyecto SPP-2225 EXIT a LB. Raissa Lerner fue parcialmente financiada por el proyecto DZHK 81X2600250 a LB y Lipidomics Core Facility. La financiación parcial para estos estudios fue proporcionada por el Lipidomics Core Facility, el Instituto de Química Fisiológica y los fondos intramuros (a LB) del Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia.

Materials

12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

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Cite This Article
Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

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