ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

ההתפתחויות האחרונות בתפקוד של שומנים ותפקידם בהופעה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות לפתוח מקומות מחקר ופיתוח חדשים של מטרות טיפוליות חדשות הבהרה מנגנון ^המחלה1. הבדלים מתועדים בהרכב השומנים באזורים שונים במוח, המודגשים על ידי טכניקות הדמיה מולקולרית מודרניות כגון הדמיית ספקטרומטריית מסה ופרופיל ספקטרומטריית מסה מתקדם, מסיט את הפרדיגמה של חקירת שומנים בדם מכל המוח לכיוון אזורי מוח שונים ודיסקרטיים מבחינה תפקודית. העובדה כי הרכב השומנים משתנה באזורים שונים במוח מעוררת תפיסה חדשה של רגישות השומנים הממברנה ואת איתות השומנים במורד הזרם בתגובה עלבון מוחי או גירויים על פני אזורי המוח ברור מבחינה תפקודית. לפיכך, פרוטוקולי השומנים דורשים פיתוחים חדשים כדי להתמודד עם האתגר של כמויות רקמות נמוכות עבור זיהוי וכימות ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, ובמקביל, ניתוח של רכיבי שומנים מרובים של קרום התא ומסלולי איתות. כמו כן, קביעת אנזימים, ליגנדים שומנים בדם, וקולטנים המעורבים בוויסות רמות ותפקודם היא בעלת חשיבות עליונה כדי להבהיר את מסלולי האיתות המושפעים במחלה נוירולוגית ולהנחות חקירות מכאניסטיות חדשות בהקשר פתופיזיולוגי.

בנוסף לרזולוציה המרחבית המוגברת במוח, ישנם שני קשיים עיקריים המאתגרים את התפתחותן של גישות נוירוליפידומיות חדשות. ראשית, מולקולות איתות השומנים הם בדרך כלל של שפע נמוך מאוד לעומת שומנים המרכיבים את הממברנה. שנית, השומנים מציגים הטרוגניות מבנית גבוהה, קשה לנתח באמצעות גישה אנליטית אחת. לפיכך, שיטות מיצוי ואנליטיות מותאמות לקטגוריות שומנים שונים ומבוצעות בדרך כלל בדגימות רקמות נפרדות². שיטות ליפידומיות של רובה ציד³ הם כלים מצוינים לחשוף במהירות פרופיל רחב של שומנים ממברנה, בעוד רגישות מוגברת וסלקטיביות הניתנות על ידי גילוי ממוקד ושיטות ספקטרומטריות מסה כימות הם מהוונים לחקירה של שומנים איתותים בשפע נמוך כולל: i) שומנים דלקתיים ii) שומנים מעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון אנדוקנבינואידים (eCBs), שומנים הקשורים חומצות אמינו, שומנים הקשורים, וכו.^4,5. כדי להקיף שינויים בשומנים הן בקרום התא והן ברמת האיתות המתרחשים באזורי המוח של מודלים של מחלות נוירולוגיות, בדרך כלל מיצוי השומנים וניתוח מתבצעים בדגימות רקמות נפרדות, המתקבלות מקבוצות בעלי חיים נפרדות או מחצי הכדור השונים, או על ידי ניתוח אזור רקמה גדול יותר לחתיכות מרובות. כאשר רמות mRNA של קולטני אנזימים הם גם עניין, החקירה שלהם בדרך כלל דורשת רכישה של דגימת רקמה ברורה. לדוגמה, החקירה של שומנים ממברנה, קנבינואידים אנדוגני, ו- mRNA ידרוש שלוש דגימות רקמות שונות, (למשל, שתי דגימות עבור שתי שיטות מיצוי שומנים – שומנים ממברנה ואיתות שומנים – ושתי שיטות ניתוח שומנים לאחר מכן – ודגימה אחת לניתוח mRNA). חקירה של שומנים דלקתיים וקנבינואידים אנדוגני דורשים שתי דגימות רקמות נפרדות, שיטות מיצוי, ושיטות ניתוח, בהתאמה. דוגמה נוספת היא חקירת mRNA ושל כל קטגוריית שומנים בדם בדגימת אגרוף למוח או מיקרודיסקציה לייזר אשר כתוצאה מכך דורש שתי בעלי חיים נפרדים כדי להשיג שתי דגימות לכל המוח (תת)אזור. מידה משמעותית של שונות ו/או רבייה לקויה של התוצאות מתרחשת לעתים קרובות במקרים כאלה, שמקורם שונות ביולוגית ו/או הטרוגניות רקמות. בהנחיית מגבלות מעשיות אלה של ניתוח רב-מולקולרי, המתרחשות במיוחד ברזולוציה מרחבית גבוהה במוח, פרוטוקול נוירוליפידומיקה בן שלושה מודולים תוכנן בהיקף: 1) דו-אופן וניתוח משותף על ידי LC / MRM של שומנים דלקתיים (למשל, איקוסנואידים (eiCs)) ושומנים המעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון eCBs²; 2) חילוץ משותף של פוספוליפידים (PLs) ו- eCBs עם LC / MRM רב-תכליתי עוקב וניתוח סריקת אובדן מבשר / נייטרלי²; ו 3) מיצוי כפול של ממברנה (פוספו)שומנים ו- eCBs, כמו גם mRNA, עם ניתוח LC / MRM ו- qPCR או RNA רצף הבאים⁶. בהתאם לשאלה הביולוגית שיש לטפל בה במחלה נוירולוגית ובאזור המוח העניין, ניתן ליישם שילוב של הפרוטוקול הראשון והשני, או הפרוטוקול הראשון והשלישי, על אותה דגימת רקמות עבור רקמות במשקל של כ -4 מ”ג. הפרוטוקולים הראשון והשלישי ניתן ליישם באופן עצמאי עבור רקמות סביב 2 מ”ג. הפרוטוקול השני יכול להיות מיושם עבור רקמות במשקל קטן כמו 0.5 מ”ג. ללא קשר למודול הפרוטוקול הנוירוליפידומי שנבחר, דגימת הרקמות ועיבוד טרום אנליטי, בידוד המוח וחיתוך האזור, כמו גם ההליך להקרבת המודל החייתי מתוקננים וזהים לכל שלושת המודולים של הפרוטוקול. בחקירה שלנו של מחלות נוירולוגיות, איברים היקפיים הרלוונטיים לתוצאות הפתולוגיות של המחלה נאספים תמיד גם ונותחים באמצעות פרוטוקולים מודולריים אלה. בנוסף, הדם נדגם באופן קבוע עבור ליפידומיקה פלזמה לשמש ככלי קריאה של מחלות נוירולוגיות עם מבט על יישומים תרגומיים פוטנציאליים. פרוטוקול השומנים המודולריים המוצגים כאן הוא רב-תכליתי מאוד: ניתן לשינוי קנה מידה לכמויות רקמות גדולות יותר וישים בקלות כמעט לכל סוג רקמה ומחלה. ליישום הפרוטוקול המודולרי (איור 1) במחלות נוירולוגיות, כל מודל מכרסמים מתוקנן של התפרצות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות, כגון פגיעה מוחית טראומטית, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או אפילפסיה הם מקובלים.

פרוטוקולים אלה יושמו בהרחבה כדי לחקור שינויים בליפידום הרקמה ו/או transcriptome בשלב החריף של אפילפסיה בחומצה קיינית (KA)-induced מודל העכבר של אפילפסיה2,7, מודל בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים בשל הדמיון לאפילפסיה האונה הטמפורלית האנושית (TLE)^8,9,10,111. באמצעות פרוטוקולים אלה, הפוטנציאל הטיפולי של תרופות כגון Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 הוערך באותו מודל עכבר של אפילפסיה. המחקר זיהה שינויים בשומנים וב-mRNA ברזולוציה מרחבית גבוהה ונמוכה במוח ובפריפריה, בנקודת הזמן של עוצמות התקפים חריפות מקסימליות (ב-60 דקות אינדוקציה פוסט-איזיותרת), ובטיפול תת-קרקעי וחריף עם PEA בארבע נקודות זמן שונות (20, 60, 120 ו-180 דקות) לאחר אינדוקציה של התקף KA, חלון זמן המכסה את השלב החריף של אפילפסיה. פלזמה, מוחות ואיברים היקפיים של עכברים לא מטופלים המוזרקים ל-KA, עכברים חריפים ומטופלים בתת-גולגולת PEA, כמו גם עכברי בקרה לרכב ו-PEA-Vehicle, נאספו בכל נקודת זמן ^12,13, ונחקרו בניתוח מולקולרי זה. הנתונים המולקולריים היו בקורלציה עם פנוטיפים התנהגותיים שהושגו על ידי ניקוד התקפים, כמו גם עם נתונים שמקורם אימונוהיסטוכימיה על תהליכים ניווניות, על מנת לפענח את ההתקדמות של שלב האפילפסיה החריפה ואת הפוטנציאל של PEA להקל עליו.