إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان
Summary
يقدم هذا البروتوكول إجراء تشغيل مختبري قياسي للاختبار التشخيصي لمستضدات فيروس ليسا في الخفافيش في تايوان.
Abstract
الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية، ويرتبط ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا مع الحالات البشرية. لأن الخفافيش هي الخزانات الطبيعية لمعظم الفيروسات الليسافية، وقد تم تنفيذ برنامج مراقبة فيروس ليسا من الخفافيش في تايوان منذ عام 2008 لفهم بيئة هذه الفيروسات في الخفافيش. وفي هذا البرنامج، تعاونت المنظمات غير الحكومية المعنية بحفظ الخفافيش والمراكز المحلية لمكافحة الأمراض الحيوانية لجمع الخفافيش الميتة أو الخفافيش التي تموت بسبب الضعف أو المرض. تم الحصول على أنسجة الدماغ من الخفافيش من خلال المحاصيل الفلورية وإخضاعها لاختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT) والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR) للكشف عن مستضدات فيروس ليسا والأحماض النووية. بالنسبة للدهون، يوصى باثنين على الأقل من التتقارنات المختلفة لتشخيص داء الكلب. بالنسبة لـ RT-PCR، تُستخدم مجموعتان من المواد التمهيدية (JW12/N165-146 وN113F/N304R) لتضخيم تسلسل جزئي لجين البروتين النووي للفيروس الليسا. يراقب برنامج المراقبة هذا الفيروسات الليسافيروسية وغيرها من العوامل الحيوانية في الخفافيش. تم العثور على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من بيبيستريلي اليابانية(Pipistrellus abramus)في 2016-2017. وينبغي أن تبلغ هذه النتائج الجمهور والمهنيين الصحيين والعلماء بالمخاطر المحتملة للاتصال بالخفافيش وغيرها من الأحياء البرية.
Introduction
الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية. هناك ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا المرتبطة الحالات البشرية1. بالإضافة إلى 16 نوعا في هذا الجنس1،2،3، تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)4 وKotalahti الخفافيش lyssavirus5 تم تحديدها مؤخرا في الخفافيش ، ولكن حالاتها التصنيفية لم يتم تحديدها.
الخفافيش هي المضيفين الطبيعيين لمعظم الفيروسات الليسافية، باستثناء موكولا ليسافيروس وإيكوما ليسافيروس، والتي لم يتم تحديدها حتى الآن في أي الخفافيش1،2،3،6. لا تزال المعلومات المتعلقة بالفيروسات الليسافية في الخفافيش الآسيوية محدودة. تم الإبلاغ عن اثنين من الفيروسات lyssasaغير مميزة في الخفافيش الآسيوية (واحد في الهند والآخر في تايلاند)7،8 تم الإبلاغ عنها. تم الإبلاغ عن حالة واحدة من حالات داء الكلب البشري المرتبطة لدغة الخفافيش في الصين في عام 2002، ولكن تم التشخيص فقط عن طريق المراقبة السريرية9. في آسيا الوسطى، تم التعرف على فيروس أرافان ليسا في الخفافيش أقل ماوس الأذنين(Myotis blythi)في قيرغيزستان في عام 1991، وتم التعرف على فيروس Khujand lyssa في الخفافيش شعيرات (Myotismystacinus)في طاجيكستان في عام 200110. في جنوب آسيا، تم التعرف على Gannoruwa الخفافيش lyssavirus في الثعلب الطائر الهندي(Pteropus medius)في سري لانكا في عام 20153. في جنوب شرق آسيا، أظهرت العديد من الدراسات المصلية على الخفافيش في الفلبين وتايلاند وبنغلاديش وكمبوديا وفيتنام الانتشار المصلي المتغير11،12،13،14، 15. على الرغم من أنه تم التعرف على فيروس إركوت ليسا في الخفافيش أكبر أنبوب أنف(مورينا leucogaster)في مقاطعة جيلين، الصين في عام 201216،لا تزال الأنواع بالضبط ومواقع lyssaviruses في مجموعات الخفافيش شرق آسيا غير معروفة.
ولتقييم وجود فيروس الليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية، بدأ تنفيذ برنامج مراقبة يستخدم كلا ً من فيروس FAT المباشر وRT-PCR. تم التعرف على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من البيبيسترلي الياباني(Pipistrellus abramus)4 في 2016-2017. في هذه المقالة، يتم إدخال إجراء تشغيل قياسي مختبري لمراقبة فيروس الليسا لسكان الخفافيش في تايوان. يتم عرض الرسم البياني لتدفق تشخيص فيروس الخفافيش في مختبرنا في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر إجراء التشغيل القياسي المختبري (SOP) عملية تسلسلية لاختبار عينات الخفافيش لوجود مستضدات فيروس ليسا في تايوان. وتشمل الخطوات الرئيسية توظيف FAT وRT-PCR. ومن المهم أيضا اختيار العينات المناسبة والعزل الناجح للفيروس. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء مراقبة lyssavirus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر تيان – تشنغ لي، ويي – تانغ لين، وشيا – جونغ تساي، ويا لان لي على مساعدتهم خلال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) من مكتب التفتيش على صحة الحيوان والنبات والحجر الصحي، مجلس الزراعة، يوان التنفيذي، تايوان.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V., Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. , 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).
- Reynes, J. -. M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. , 3-8 (1996).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. . The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).
- Epstein, J. H., Field, H. E., Wang, L. F., Cowled, C. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. , 249-280 (2016).
- . Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019)
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S., Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. , 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A., Jackson, A. C. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. , 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses–results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
