Summary

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Published: April 24, 2019
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Summary

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Abstract

Métodos actuales que utiliza habitualmente para cuantificar el mRNA en ovocitos y embriones incluyen la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa digital (dPCR), cuantitativo, en tiempo real RT-PCR (RT-qPCR) y la secuencia de RNA. Cuando estas técnicas se realizan con un solo óvulo o embrión, copia baja mRNAs no se detectan confiablemente. Para superar este problema, ovocitos o embriones pueden se agruparon para el análisis; sin embargo, esto conduce a menudo a la alta variabilidad entre las muestras. En este protocolo, describimos el uso de hibridación fluorescente in situ (FISH) usando química de DNA ramificado. Esta técnica identifica el patrón espacial de mRNAs en células individuales. Cuando la técnica es encontrar lugar y seguimiento informático, también puede cuantificar la abundancia de mRNAs en la célula. Usando esta técnica, hay menor variabilidad dentro de un grupo experimental y se requieren menos ovocitos y embriones para detectar diferencias significativas entre los grupos experimentales. Comercialmente disponible DNA ramificado SM-kits de peces han sido optimizados para detectar mRNAs en tejidos seccionados o células adherentes en diapositivas. Sin embargo, ovocitos no eficazmente a diapositivas y algunos reactivos en el kit eran demasiado duros, resultando en lisis de ovocitos. Para evitar esta lisis, se hicieron varias modificaciones al kit de pescado. Específicamente, buffers de permeabilización y lavado de ovocitos diseñadas para la inmunofluorescencia de oocitos y embriones reemplazados los almacenadores intermediarios del propietarios. La permeabilización, lavados e incubaciones con amplificador y puntas de prueba fueron realizadas en placas de 6 pocillos y ovocitos fueron colocados en portaobjetos en el extremo del protocolo utilizando medios de montaje. Estas modificaciones fueron capaces de superar las limitaciones del kit disponible comercialmente, en particular, la lisis de ovocitos. Precisa y reproducible, contar el número de los mRNAs de los ovocitos, se utilizó el software de computadora. Juntos, este protocolo representa una alternativa a la PCR y secuenciación para comparar la expresión de las transcripciones específicas en las células.

Introduction

Reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa (PCR) ha sido el estándar de oro para la cuantificación del mRNA. Actualmente se utilizan dos ensayos PCR (dPCR) digital1 y cuantitativa, real time PCR (qPCR)2 . De las dos técnicas PCR, dPCR tiene mayor sensibilidad que la qPCR sugiriendo que podría ser utilizado para medir la abundancia de ARNm en células individuales. Sin embargo, en nuestras manos, análisis de dPCR de mRNAs de baja abundancia en grupos de 5 a 10 ovocitos por cada muestra experimental ha producido datos con baja reproducibilidad y alta variación3. Esto es probablemente debido al error experimental asociado a la extracción de RNA y transcripción reversa eficiencia. La secuencia de RNA también se ha realizado utilizando un único ratón y ovocitos humanos4,5. Esta técnica requiere pasos de amplificación de cDNA para la generación de biblioteca que probablemente aumenta la variabilidad dentro de un grupo experimental. Además, las transcripciones de baja abundancia no pueden ser detectables. Aunque los precios de la secuencia han bajado en los últimos años, todavía puede ser prohibitivo debido al costo alto de Bioinformática análisis de costo. Por último, la localización de mRNA es un proceso dinámico con cambios espaciales que contribuyen a la función de la proteína6. Por lo tanto, nos propusimos adoptar una técnica que produciría medidas cuantitativas precisas y reproducibles y localización de los mRNAs individuales en ovocitos solo.

DNA ramificado juntada a hibridación fluorescente in situ amplifica la señal de fluorescencia en lugar de amplificar RNA/cDNA que permite detección de mRNAs individuales en células individuales 7,8,9. El ensayo se realiza a través de una serie de hibridación, amplificación (usando ADN ramificado) y fluorescencia de etiquetado pasos para amplificar la señal de la fluorescencia del7. La técnica comienza con el atascamiento de pares de sonda de 18 – 25 base de oligonucleótidos que son complementarias a un ARNm específico3,8,10. Quince a veinte pares de sonda están diseñados para cada especificidad asegurando de transcripción para la transcripción de destino. La hibridación específica del mRNA es seguida por sondas de preamplificador y amplificador que forman una configuración ramificada. Aproximadamente, 400 etiqueta fluoróforos se unen a cada amplificador, resultando en un 8000-fold incremento de fluorescencia que permite la detección de mRNAs individuales (figura 1)11.

Figure 1
Figura 1: esquema del protocolo SM-pescado. Hibridación secuencial de sonda específica de la transcripción, ramificado ADN amplificador y fluoróforo a un mRNA se muestra de destino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estudios previos usando in situ hibridación (SM-pescado) localizado β-actina mRNAs en neuronas individuales12 y papillomavirus humano DNA en cáncer de cuello uterino fluorescencia sola molécula célula líneas7. El software de computadora encontrar lugar y programa de seguimiento identifica la señal fluorescente punteada individual y se ha utilizado con éxito para cuantificar el número de mRNAs en cada célula3,13.

Basado en los resultados de la detección de mRNA en las neuronas12, presumimos que SM-pez sería una herramienta útil para cuantificar los niveles de transcripción en murinos ovocitos y embriones incluyendo mRNAs de baja abundancia. Sin embargo, la técnica está optimizada para el uso con las células fijas adherentes y formaldehído fijada parafina incorporado secciones de tejido (FFPE). Ovocitos no se adhieren a un portaobjetos, incluso cuando están recubiertos con poli-l-lisina. Además, son más frágiles que las células somáticas y las secciones de tejido que resulta en lisis celular cuando se someten a algunos de los buffers propietarios en kits disponibles en el mercado3. Para superar estos desafíos, ovocitos fueron fijos y transferidos manualmente entre las gotas de los amortiguadores. Además, buffers de permeabilización y lavado en los kits fueron substituidos para reducir la lisis celular. Sondas prediseñadas se compran junto con el kit de peces o pueden solicitar transcripciones específicas. Cada conjunto de sonda patentada está disponible en uno de los tres canales de fluorescencia (C1, C2 y C3) para permitir la multiplexación. En el experimento actual, oocitos murinos fueron cuantificados utilizando una sonda C2 Nanog y una sonda de C3 Pou5f1 y doble tinción. Estas sondas se seleccionaron con base en la expresión divulgada de Nanog y Pou5f1 en ovocitos y embriones. En la conclusión de los pasos de hibridación, ovocitos fueron colocados en gotas anti-fade del medio de montaje para aplicación a las diapositivas histológicas. Imágenes confocales fueron utilizados para cuantificar el número de señales fluorescentes punteadas que representan los mRNAs. Además de cuantificar los mRNAs, proyección de imagen demostró también la distribución espacial de los mRNA específicas en la célula, que otros métodos de cuantificación de RNA son incapaces de lograr. Esta técnica demostró para tener poca variabilidad dentro de un grupo experimental que permite el uso de un número menor de ovocitos en cada grupo experimental para identificar diferencias significativas entre grupos experimentales3.

Protocol

Procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la Universidad de Nebraska-Lincoln y todos los métodos fueron realizados conforme a las normas y directrices pertinentes. Para este estudio, CD-1 marginado ratones tuvieron acceso ad libitum a chow roedor normal y agua; se mantuvieron en un 12:12 oscuras: ciclo de luz. 1. preparación de medios necesarios Para los medios de base (OMM), añadir 100 mM NaCl, KCl de 5 mM, 0,5 mM KH…

Representative Results

Al finalizar el protocolo, el resultado es imágenes individuales de la serie z confocal (Figura 4A y figura 5), cosido de imágenes (figura 4), y mRNA cuenta (Figura 4B). Cuando se realiza la multiplexación, también habrá combinados imágenes que muestran la etiqueta de dos mRNAs diferentes (<strong class="xf…

Discussion

Una serie de pasos pequeños durante el protocolo asegurará de fluorescencia exitosa y precisa de mRNAs. En primer lugar, el protocolo debe realizarse inmediatamente después de recogida y fijación de los ovocitos. Tenga en cuenta que PVP se ha agregado el buffer de fijación de paraformaldehído al 4% para evitar que los ovocitos se pegue uno al otro. Encontramos que es necesario realizar el experimento inmediatamente después de la recogida y fijación de los ovocitos. Cualquier retraso se traduce en una mucho menor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dr. Daniel R. Larson por su generosa ayuda con la instalación y uso del programa de seguimiento y encontrar lugar 13 y el apoyo técnico de la Universidad de Nebraska Lincoln microscopia base para la proyección de imagen de microscopía confocal. Este estudio representa una contribución de la Universidad de la división de investigación agrícola de Nebraska, Lincoln, Nebraska y fue apoyado por fondos de la portilla de UNL (NEB-26-206/número de-232435 y NEB-26-231/número de-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

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Cite This Article
Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

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