Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der Goldstandard für die mRNA Quantifizierung. Derzeit werden zwei Assays, digitale PCR (dPCR)¹ und quantitative, real Time PCR (qPCR)² verwendet. Die zwei PCR-Techniken hat dPCR höhere Empfindlichkeit als qPCR darauf hindeutet, dass es verwendet werden, könnte um mRNA Fülle in einzelnen Zellen zu messen. Aber in unseren Händen produziert dPCR Analyse der niedrigen Fülle mRNAs in Pools von 5 bis 10 Eizellen pro jede experimentelle Probe Daten mit geringen Reproduzierbarkeit und hohe Variation³. Dies ist wahrscheinlich auf die experimentellen Fehler in Verbindung mit RNA-Extraktion und reversen Transkription Effizienz. RNA-Sequenzierung wurde auch mit einem einzigen Mausklick und menschliche Eizellen^4,5durchgeführt. Diese Technik erfordert cDNA Verstärkung für die Bibliothek-Generation, die wahrscheinlich erhöht die Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erforderlichen Schritte. Darüber hinaus können niedrige Fülle Protokolle nicht nachweisbar sein. Obwohl Sequenzierung Preise ab den letzten Jahren gestiegen sind, kann es noch unerschwinglich wegen der hohen Kosten der Bioinformatik Analysen sein. Zu guter Letzt ist mRNA Lokalisierung ein dynamischer Prozess mit räumlichen Veränderungen zur Protein-Funktion⁶. Daher setzen wir um eine Technik zu verabschieden, die genaue und reproduzierbare quantitative Maßnahmen und Lokalisierung der einzelnen mRNAs in einzelne Eizellen produzieren würde.

Verzweigte DNA gekoppelt mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verstärkt Fluoreszenzsignal eher als verstärkendes RNA/DNA ermöglicht Nachweis von einzelnen mRNAs in einzelnen Zellen ^7,8,9. Der Test erfolgt durch eine Reihe von Hybridisierung, Amplifikation (mit verzweigten DNA) und Fluoreszenz Kennzeichnung Schritte um die Fluoreszenz-Signal⁷verstärken. Das Verfahren beginnt mit der Bindung von 18 – 25 Base Oligonukleotid-Sonde-Paare, die einen spezifischen mRNA^3,8,10ergänzen. Fünfzehn bis zwanzig Sonde Paare eignen sich für jedes Protokoll Gewährleistung Spezifität für das Ziel-Transkript. Die mRNA-spezifische Hybridisierung folgt Vorverstärker und Endstufe Sonden, die eine verzweigte Konfiguration bilden. Ungefähr binden 400 Label Fluorophore an jeden Verstärker, was zu einem 8000-fold Anstieg in Fluoreszenz ermöglicht die Erkennung von einzelnen mRNAs (Abbildung 1)¹¹.

Abbildung 1: Schematische des SM-Fisch Protokolls. Sequenzieller Hybridisierung von Transkript Sonde, verzweigte DNA-Verstärker und Fluorophor, ein Ziel-mRNA gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Frühere Studien mit Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SM-Fisch) lokalisiert β-Aktin mRNAs in einzelnen Neuronen¹² und humanes Papillomavirus DNA bei Gebärmutterhalskrebs Zell-Linien⁷. Die Computersoftware, die Stelle zu finden und Tracking-Programm identifiziert einzelne punktförmige Fluoreszenzsignal und wurde erfolgreich verwendet, um die Anzahl der in jeder Zelle^3,13mRNAs zu quantifizieren.

Basierend auf den Ergebnissen der mRNA-Erkennung in Neuronen¹²vermutet wir, dass SM-Fisch ein nützliches Instrument zur Abschrift Ebenen in murinen Eizellen und Embryonen einschließlich niedrige Fülle mRNAs quantitate beweisen würde. Aber die Technik ist optimiert für die Verwendung mit festen adhärente Zellen und Formaldehyd fixiert Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (FFPE). Eizellen können nicht zu einer Folie haften, auch wenn sie mit Poly-L-Lysin beschichtet sind. Darüber hinaus sind sie empfindlicher als Körperzellen und Gewebeschnitte was in Zelle Lysis, wenn einige der proprietären Puffer in kommerziell erhältlichen Kits³ausgesetzt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden Eizellen behoben und manuell zwischen Tropfen der Puffer übertragen. Darüber hinaus wurden Permeabilisierung und waschen Puffer in den Kits ersetzt, um die lyse der Zellen zu verringern. Vordefinierte Sonden sind neben dem Fisch-Kit gekauft oder bestimmte Protokolle angefordert werden können. Jedes proprietäre Sonde-Set ist erhältlich in einer der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3) multiplexing zu ermöglichen. Im aktuellen Experiment wurden murine Eizellen Dual-gebeizt und quantifizierte mit einer Sonde C2 Nanog und C3 Pou5f1 Sonde. Diese Sonden wurden anhand der gemeldeten Ausdruck von Nanog und Pou5f1 in Eizellen und Embryonen ausgewählt. Zum Abschluss der Hybridisierung Schritte wurden Eizellen in Tropfen von Anti-Fade Montage Medien für die Anwendung auf histologischen gelegt. Konfokale Bilder wurden verwendet, um die Anzahl der punctata fluoreszierende Signale zu quantifizieren, die einzelnen mRNAs darstellen. Neben der Quantifizierung der mRNAs Bildgebung zeigte auch die räumliche Verteilung der spezifischen mRNA in der Zelle sind die RNA-Quantifizierungsmethoden nicht in der Lage, zu erreichen. Dieses Verfahren erwies sich geringe Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erlaubt die Verwendung einer kleineren Anzahl von Eizellen in jeder experimentellen Gruppe signifikante Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen³identifizieren.