Co kleuring bloedvaten en zenuwvezels in adipeus weefsel
Summary
Nieuw bloed vaartuig vorming en sympathieke innervatie arm spelen cruciale rol in het adipeus weefsel remodeling. Er blijven echter technische problemen in het visualiseren en kwantitatief meten van vetweefsel. Hier presenteren we een protocol om met succes een label en de dichtheden van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende vetweefsel kwantitatief te vergelijken.
Abstract
Recente studies hebben gewezen op de kritische rol van angiogenese en sympathieke innervatie arm in adipeus weefsel remodeling tijdens de ontwikkeling van obesitas. Daarom is het noodzakelijk de ontwikkeling van een gemakkelijke en efficiënte methode om te documenteren van de dynamische veranderingen in adipeus weefsel. Hier beschrijven we een gemodificeerde immunefluorescentie benadering die efficiënt mede bloedvaten en zenuwvezels in vetweefsel vlekken. Vergeleken met traditionele en onlangs ontwikkelde methoden, is onze aanpak relatief makkelijk te volgen en efficiënter in de bloedvaten en zenuwvezels met hogere dichtheden en minder achtergrond benoemen. Bovendien, de hogere resolutie van de beelden verder laat ons toe om nauwkeurige meting van het gebied van de schepen, de hoeveelheid vertakking en de lengte van de vezels door de open source-software. Als een demonstratie met onze methode, laten we zien dat bruin vetweefsel (BAT) bevat hogere bedragen van bloedvaten en zenuwvezels in vergelijking met witte vetweefsel (WAT). We verder zoeken dat onder de WATs, subcutane WAT (sWAT) heeft meer bloedvaten en zenuwvezels in vergelijking met epididymaire WAT (eWAT). Onze methode biedt dus een nuttig instrument voor het onderzoeken van adipeus weefsel remodeling.
Introduction
Vetweefsel heeft sleutel metabole en endocriene functies1. Het dynamisch vergroot of verkleind in een reactie op verschillende voedingsstoffen benadrukt2. Het actieve weefsel remodeling proces bestaat uit meerdere fysiologische paden/stappen met inbegrip van angiogenese, fibrose en vormgeven van lokale inflammatoire microenvironments2,3,4. Bepaalde fysieke prikkels, zoals koude blootstelling en lichaamsbeweging, kunnen leiden tot sympathiek activering, die uiteindelijk tot de vorming van nieuw bloed vaartuig en sympathieke innervatie arm in vetweefsel5,6 leidt. Deze remodelleert processen zijn nauw verbonden met systemische metabole resultaten, met inbegrip van insulinegevoeligheid, het kenmerk van type 2 diabetes2. Visualisatie van deze pathologische veranderingen is dus zeer belangrijk voor het begrip van de gezonde status van hele vetweefsel.
Angiogenese is het proces van de vorming van nieuw bloed vaartuig. Aangezien bloedvaten zuurstof, voedingsstoffen en hormonen, groeifactoren aan weefsel, angiogenese is beschouwd als een belangrijke stap in het adipeus weefsel remodeling, die heeft aangetoond met verschillende technieken6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. er blijven echter vragen over de resolutie van de beelden, de doeltreffendheid van immunokleuring en methoden voor de kwantificering van de dichtheid van het vaartuig. Vergeleken met vorming van nieuw bloed vaartuig, is innervatie arm in adipeus weefsel onderschat voor een lange tijd. Onlangs, Zeng et al.. 14 gebruikt geavanceerde intravital twee-foton microscopie en aangetoond dat adipocytes worden omgeven door lagen van zenuwvezels14. Sindsdien zijn onderzoekers begonnen met het waarderen van de centrale rol van de sympathieke innervatie arm in verordening van vetweefsel fysiologie. Ontwikkelen van een eenvoudige en praktische benadering van document obesitas zenuw innervatie arm is dus belangrijk.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde methode voor de co kleuring van bloedvaten en zenuwvezels, gebaseerd op onze eerdere protocollen. Met deze methode kunnen we duidelijke beelden van bloedvaten en zenuwvezels zonder lawaaierige achtergrond. Bovendien krijgen we een resolutie die hoog genoeg is voor het uitvoeren van kwantitatieve meting van dichtheden met open sourcesoftware. Met behulp van deze nieuwe aanpak, kunnen we met succes het vergelijken van de structuren en de dichtheid van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende obesitas depots.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipeus weefsel remodeling is direct gekoppeld aan metabole disregulatie tijdens obesitas ontwikkeling1,2. Angiogenese en sympathieke innervatie arm zijn beide essentieel voor de dynamische remodelleert proces2,12. Ontwikkelen van een toepassing aanpak om te visualiseren van de nieuwe bloedvaten, evenals de zenuwvezels zijn dus van groot belang. Vorige methoden zijn gemeld voor het documenteren van de ang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Institute of Health (NIH) subsidie R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
