Summary

شارك تلطيخ الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية

Published: February 13, 2019
doi:

Summary

تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة مع لعب دور محوري في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء. ومع ذلك، لا تزال هناك مسائل تقنية في تصور وقياس كمية الأنسجة الدهنية. نقدم هنا بروتوكولا للتسمية بنجاح والكمية مقارنة كثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية.

Abstract

الدراسات التي أجريت مؤخرا قد أبرزت الدور الحاسم للأوعية وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء أثناء تطوير السمنة. ولذلك فمن الضروري وضع طريقة سهلة وفعالة لتوثيق التغيرات الدينامية في الأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف نهجاً إيمونوفلوريسسينت تعديل كفاءة المشترك البقع الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية. مقارنة بالأساليب التقليدية ووضعت مؤخرا، نهجنا سهلة نسبيا لمتابعة وأكثر كفاءة في وسم الأوعية الدموية والألياف العصبية ذات الكثافة أعلى وأقل الخلفية. وعلاوة على ذلك، دقة أعلى للصور كذلك يسمح لنا بدقة قياس منطقة السفن، ومقدار المتفرعة، وطول الألياف ببرمجيات المصدر المفتوح. وكدليل على استخدام أسلوب لدينا، نحن إظهار تلك الأنسجة الدهنية براون (BAT) يحتوي على كميات أعلى من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بالانسجة الدهنية البيضاء (وات). كذلك تجد أن وات تحت الجلد (سوات) قد بين حدى، المزيد من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بوات البربخيه (أوت). لدينا أسلوب مما يوفر أداة مفيدة للتحقيق في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء.

Introduction

الأنسجة الدهنية مفتاح الأيضية ووظائف الغدد الصماء1. أنه يوسع بشكل حيوي أو ينكمش استجابة لمختلف المواد الغذائية تؤكد2. الأنسجة النشطة إعادة عرض عملية تتكون من خطوات مسارات الفيزيولوجية متعددة بما في ذلك الأوعية والتليف وتشكيل ميكرونفيرونمينتس التهاب المحلية2،،من34. قد تؤدي بعض المحفزات المادية، مثل التعرض للبرد وممارسة، تتعاطف مع التنشيط، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية5،6. ترتبط هذه العمليات إعادة عرض محكم بالنتائج الاستقلابية الجهازية تشمل حساسية الأنسولين، السمة المميزة للنوع 2 من داء السكري2. وهكذا تصور هذه التغيرات الباثولوجية مهم جداً لفهم الوضع الصحي لكل الأنسجة الدهنية.

تولد الأوعية هو عملية تشكيل السفينة دماء جديدة. منذ الأوعية الدموية توفير الأوكسجين والمغذيات والهرمونات وعوامل النمو للأنسجة، تولد الأوعية اعتبرت خطوة رئيسية في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء، الذي تم توثيقه مع تقنيات مختلفة6،7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة حول دقة الصور، وكفاءة إيمونوستينينج، وأساليب القياس الكمي لكثافة السفينة. بالمقارنة مع تشكيل السفينة دماء جديدة، تم التقليل تعصيب في الأنسجة الدهنية لفترة طويلة. ومؤخرا، تسنغ et al. 14 استخدام متقدمة إينترافيتال اثنين-فوتون مجهرية وأثبتت أن adipocytes تكون محاطة بطبقات من الألياف العصبية14. ومنذ ذلك الحين، بدأ الباحثون نقدر الدور المحوري تعصيب متعاطفة في التنظيم لفسيولوجيا الأنسجة الدهنية. وبالتالي، من المهم وضع نهج عملية وسهلة تعصيب العصب الدهنية الوثيقة.

هنا، لدينا تقرير أسلوب أمثل لتلطيخ المشترك من الأوعية الدموية والألياف العصبية استناداً إلى أن البروتوكولات السابقة. بهذه الطريقة، يمكننا أن نحقق صور واضحة للأوعية الدموية والألياف العصبية دون ضجيج الخلفية. وعلاوة على ذلك، نحصل على قرار عالية بما يكفي لإجراء قياس كمي للكثافات مع برمجيات المصدر المفتوح. باستخدام هذا النهج الجديد، يمكننا بنجاح مقارنة بالهياكل وكثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف المستودعات الدهنية.

Protocol

جميع الإجراءات التي تتضمن مواضيع الحيوان عليها من مركز علوم الصحة “الحيوانية رعاية اللجنة من جامعة تكساس” في هيوستن (رقم بروتوكول الحيوان: الائتلاف المناهض للحرب-18-0057). 1-كاشف إعداد 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4): جعل ل 1 لبرنامج تلفزيوني 1 x، حل ز 0.2 من بوكل …

Representative Results

وجمعت المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخيه (أوت)، ومنطقة وسطى من دورسولومبار تحت الجلد بيضاء الأنسجة الدهنية (سوات)، ومنطقة وسطى من النسيج الدهني البنى إينتيرسكابولار (BAT). يتم الإشارة إلى المواقع لجمع هذه الأنسجة في الشكل 1. <p class="jove_content" …

Discussion

إعادة عرض الأنسجة الدهنية يرتبط ارتباطاً مباشرا بالتقلبات الأيض أثناء السمنة التنمية1،2. الأوعية وتعصيب متعاطفة كلاهما ضروري لعملية إعادة عرض ديناميكية2،12. ولذلك، وضع نهج المطبقة لتصور الأوعية الدموية الجديدة، فضلا عن الأل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة المعهد الوطني للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منحة R01DK109001 (كانساس).

Materials

Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D=0.17mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  3. Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
  4. Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
  5. Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
  7. Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
  8. Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
  9. During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
  10. Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
  11. Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
  12. Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
  13. Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
  14. Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  16. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  17. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  18. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  19. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  20. An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
  21. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).

Play Video

Cite This Article
Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

View Video