Koalak'da Kortizol Ölçümü (Phascolarctos cinereus) Kürk
Summary
Koala kürkünden kortizol ölçümü için en uygun ekstraksiyon çözücüsünü belirlemek için bir protokol sayılacağız. Bu protokolde kullanılan çözücüler metanol, etanol ve isopropanol’dür. Optimal bir ekstraksiyon çözücü belirlenmesi koalalar üzerinde kronik stresin etkisini belirlemek için güvenilir ölçüm kürk yardımcı olacaktır.
Abstract
Örnek türleri arasında hayvanlarda stresi ölçmek için kullanılan hormon ekstraksiyon optimal yöntemler her zaman aynı değildir. Avustralya’nın ikonik keseli türleri, koala(Phascolarctos cinereus),antropojenik kaynaklı stres ve yabani popülasyonlarda kronik stres indeğerlendirilmesi uzun süreli maruz kalma karşı karşıya acilen garanti edilir. Kronik stresi ölçmenin en etkili yollarından biri, fizyolojik ve davranışsal tepkileri desteklediği için saç veya kürkteki glukokortikoid hormon kortizolünün analizidir. Bu laboratuvar doğrulama çalışması, koala kürkünde kortizolün non-invaziv bir ölçütü olarak kullanılacak optimal hormon ekstraksiyon yöntemini doğrulamak için mevcut teknikleri test etmeyi amaçlamaktadır. Stres hormonlarını ölçmek için non-invaziv teknikler kullanmanın, ideal pratik ve etik bakış açıları nedeniyle geleneksel, invaziv tekniklere tercih olduğu kabul edilmektedir. Ayrıca koalalardan kürk elde etmek kan örneklerinden elde etmekten nispeten daha kolaydır. Bu çalışmada, optimal kortizol ekstraksiyon yöntemini doğrulamak amacıyla bir dizi hormon çıkarma tekniğini çalıştırmak için Adelaide Koala ve Vahşi Yaşam Hastanesi’nden alınan koala kürkü örnekleri kullanılmıştır. Sonuçlar, %100 metanolün paralellik sonuçlarına göre %100 etanol veya %100 izopropanol ile karşılaştırıldığında en uygun çözücü ekstraksiyonu sağladığını göstermiştir. Sonuç olarak, koala kürkkortizol ekstraksiyon bu yöntem koalalarda kronik stres çalışma için kullanılabilecek güvenilir bir non-invaziv bir titret sağladı.
Introduction
Avustralya ekosistemleri diğer birçok dinamik etkileşimlerarasındagıda ve lif dahil olmak üzere hizmetlerin sağlanması yoluyla insan hayatını sürdürmek 1. İronik olarak, biyolojik çeşitlilik değişimi ile ekosistem bozulmasının baskınitici gücü olarak çalışan insan aktivitesidir 2. Habitat parçalanma, arazi küçük yamalar halinde büyük sürekli habitatlar bölme süreci olarak bilinen, birbirinden izole, Avustralya ekosistemleri tehdit eden büyük antropojenik biyoçeşitlilik değişimi2. Habitat parçalanması herhangi bir alandaki türlerin bileşiminin yapısını ve çeşitliliğini değiştirerek, bu türlerin canlı popülasyonları korumak için gerekli olan habitat alanını azaltır2. Bunun sonucu gıda, yakıt, lif vesu3 dahil olmak üzere kaynaklar için türler arasındaki rekabet artmaktadır. Biyolojik çeşitlilik değişimi ile Avustralya ekosistemlerinin imha birçok Avustralya yerlitürler üzerinde felaket sonuçlara sahip 1.
Avustralya’nın en ikonik keseli türler, koala(Phascolarctos cinereus),Avustralya ekosistemleri hayatta kalmak için sağlıklı kalan bağlıdır4. Avrupa Yerleşimi’nin başlatılması koalaavustralya popülasyonlarında hızlı bir düşüşe neden oldu, onlar büyük bir ihracat ticaretikar peşinde kendi pelts için katledildi 5. Bu uygulama 1980’lerde yasaklandı ve koala popülasyonları daha sonra5stabilize başardık. Ancak, insan nüfusunun üstel büyüme bu türün yaşam alanlarının büyük bir kısmı için rekabetsonuçlandı ve hayatta kalmaları yine tehdit altında 6. Uluslararası Doğayı Koruma Birliği’ne (IUCN) göre, Avustralya koalalarının tüm popülasyonları azalan nüfuseğilimi7 ile yok olmaya karşı savunmasız olarak listelenmiştir. Bu liste, ilgili nüfus parametreleri etrafındaki belirsizliğe atfedilirve bu tür için popülasyon eğilimlerinde belirgin bir değişim 7. En ikonik ve endemik hayvanlar olan koalalar, turizm yoluyla Avustralya ekonomisine büyük ölçüde fayda sağlamaktadır (NSW Çevre ve Miras Ofisi 2018). Yapılan tahminlere göre koala turizmi yaklaşık 9.000 kişiye iş sağladı ve ekonomiye 1.1 ila 2.5 milyar dolar arasında katkıda bulundu (NSW Çevre ve Miras Ofisi 2018). Herhangi bir türün kaldırılması felaket olma potansiyeline sahiptir, ve yerli Avustralya yaban hayatı sürekli düşüş görülebilir6. Ayrıca, Avustralya koalalarının popülasyonları6oranında azalmaya devam ederse Avustralya ekonomisi nin sonuçları hissedilecektir.
Habitat parçalanmasına yanıt olarak ölüm ve hastalık prevalansının kronik stresin sonucu olduğu ileri sürülmaktadır8. Zaten, yirmi dört keseli türler avustralya’da habitat parçalanma nedeniyle soyu tükenmiş ilan edilmiştir, koalalar benzer bir eğilim aşağıdaki8. Habitat parçalanma ve biyolojik sistemlerin karmaşıklığı sinerjik ama stres yanıtı analizi ile çözülebilir6. Genellikle, bir hayvan doğal ortamda herhangi bir rahatsızlık nörohormonal olayların karmaşık bir çağlayan aktive, bir ‘mücadele veya uçuş’ yanıtı olarak bilinen9,10. Strese verilen bu yanıt, hipotalamik-hipofiz-adrenal (HPA) ekseninin aktive edildiği beyinde başlayan bir süreçtir11. Hipotalamus denilen beynin bir bileşeni kortikotrofin salgılayan hormon bültenleri (CRH), daha sonra adrenokortikotrofik hormon serbest bırakmak için ön hipofiz sinyalleri (ACTH)11. Bu da adrenal medulla gelen glukokortikoid salgısını uyarır. Vücut glikoz depolarını glikojenden uzaklaştıran ve glikozu depolanan glikojen11’denharekete geçirerek kan yoluyla glukokortikoidler dolaşır. Nörohormonal olayların Bu çağlayan öngörülemeyen uyaranlar ile başa çıkmak için hayvan tarafından kullanılan tepkidir11. Ancak, glukokortikoidler serbest bırakılır ve uzun bir süre için yüksek kalır, hayvan kronik stres yaşıyor olarak kabul edilir12,13. Bu süreç, devam eden glukokortikoid üretimi için gerekli olduğu gibi, enerjiyi diğer onbaşı bedensel işlevlerden uzaklaştırmayı içerir13. Sonuç olarak, kronik stres büyüme, üreme ve bağışıklık yasaklayabilir, tüm önemli fitness özellikleri hayatta kalmak için gerekli olan14.
Bir hayvanın glukokortikoid üretiminin ölçülmesi, hayvanın fizyolojik stres yaşanıp yaşamadığını belirlemek için kullanılan yaygın bir göstergedir15. Bunu yapmak için, glukokortikoidler kan plazması, serum, tükürük, idrar veya dışkı16ölçülebilir. Ancak, kanıtlar saç kronik stres çok daha etkili bir göstergesi olduğunu göstermektedir, yukarıda belirtilen aksine16. Saç büyüme aşamasında kan yoluyla gelen hormonlar dahil düşünülmektedir olmasıdır; nispeten kararlıdır; ve saçta tespit edilen herhangi bir kortizol, saç büyüme döneminde yaşanan fizyolojikstresi yansıtır, bu da haftalar ile 16 ay arasında olabilir. Ayrıca, kortizol herhangi bir koleksiyon yakalama ve 16 işleme ile ilişkilistresi en aza indirmek için non-invaziv olmalıdır. Ancak, bu olay sırasında yaşanan herhangi bir stres saç glukokortikoid düzeylerini etkilemez16. Hayvanların bir dizi uzun vadeli stres ölçmek için saç kullanma yeterliliğini keşfetmek birçok çalışma olmuştur, ve ren geyiği üzerinde çalışmalar dahil, boz ayılar, rhesus maymunlar, muskoxen, ve kahverengi ayılar17,18, 19.09.20 , 20.000 , 21. Saç kortizol genellikle saç yüzeyinde biriken ter ve sebum türetilmiş kortizol sağlamak için ilk örnek yıkanarak ayıklanır co-kortizol ile ayıklanırve daha sonra bir boncuk-beater 22 örnek pulverizing değildir. Yıkandıktan sonra, numunenin tam buharlaşma sağlamak için kurutulması gerekir22. Son olarak, bir çözücü kullanılarak, numune ayıklanabilir ve kortizol 22tsay kolaylaştırmak için yeniden oluşturulabilir. Kürk kortizol ayıklamak için kullanılan en yaygın çözücü metanol21,23; ancak, kortizol çıkarma tekniklerinde etanol ve izopropanol kullanan bazı çalışmalar vardır. Örneğin, etanol kullanılan bir çalışma insan amniyotik sıvı24kortizol ayıklamak için başarılı oldu. Ayrıca, kullanılan izopropanol kullanılan bir çalışma insan saç ve tırnak25,26kortizol ayıklamak için başarılı oldu. Bu nedenle, bu çalışmada koala kürkü örneklerinden kortizol çıkarılması için en başarılı olduğunu belirlemek için her üç çözücüler (metanol, etanol ve izopropanol) test edilmiştir.
Bu çalışmanın temel amacı, koala kürkünden kortizolün non-invaziv bir ölçütü olarak kullanılmak üzere optimal hormon ekstraksiyon tekniğini doğrulamak için mevcut teknikleri kullanmaktır. Bu üç ekstraksiyon çözücüler test edilerek elde edildi (metanol, etanol, ve isopropanol). Biz metanol koala kürk kortizol ayıklamak için kullanılan optimal çözücü olacağını varsayılmış çünkü Arbor tsay kortizol kitleri tarafından ekstraksiyon önerilen çözücü27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli kürkkortizol tespit etmek için teknikler bir dizi kullanmak çalışmalar vardır. Bu çalışma, mevcut antropojenik strese maruz kalan yabani bir koaladan toplanan kürkkortizol tespiti için sonuçlar sunmaktadır. Bu çığır açan çalışmada koala kürk kronik stres bir ölçüsü olan kortizol ayıklama en iyi üç yaygın olarak kullanılan çözücüler hangi test etmek için kürk kullanılır. Sonuçlar% 100 metanol memeli kürk bu tür kortizol ekstraksiyon için önerilen çözücü olduğunu gös…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Edward Narayan için Western Sydney Üniversitesi, Bilim ve Sağlık Okulu aracılığıyla start-up araştırma fonu ile desteklenmiştir. Yazarlar örnek işleme ile yardım için Jack Nakhoul teşekkür ederim.
Materials
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World’s Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
