Medición de cortisol en Koala (Phascolarctos cinereus) Piel
Summary
Presentamos un protocolo para determinar el disolvente de extracción óptimo para medir el cortisol del pelaje de koala. Los disolventes utilizados en este protocolo son metanol, etanol e isopropanol. Determinar un disolvente de extracción óptimo ayudará a medir de forma fiable el pelaje para determinar el impacto del estrés crónico en las koalas.
Abstract
Los métodos óptimos de extracción hormonal utilizados para medir el estrés en animales a través de los tipos de muestra sin ser siempre los mismos. La icónica especie marsupial de Australia, el koala (Phascolarctos cinereus), se enfrenta a una exposición prolongada a factores de estrés inducidos por antropogénicos y la evaluación del estrés crónico en las poblaciones silvestres está justificada con urgencia. Una de las maneras más eficaces de medir el estrés crónico es a través del análisis de la hormona glucocorticoides cortisol en el cabello o el pelaje, ya que apoya las respuestas fisiológicas y conductuales. Este estudio de validación de laboratorio tiene como objetivo probar las técnicas actuales para validar un método óptimo de extracción hormonal que se utilizará como una medida no invasiva de cortisol en piel de koala. Se reconoce que el uso de técnicas no invasivas para medir las hormonas del estrés se prefiere sobre las técnicas tradicionales, invasivas debido a sus puntos de vista prácticos y éticos ideales. Además, es comparativamente más fácil adquirir piel de koalas que adquirir muestras de su sangre. Este estudio utilizó muestras de piel de koala adquiridas del Adelaide Koala and Wildlife Hospital para ejecutar una serie de técnicas de extracción de hormonas en un intento de validar un método óptimo de extracción de cortisol. Los resultados mostraron que el 100% de metanol proporcionaba la extracción de disolvente más óptima en comparación con 100% etanol o 100% isopropanol basado en resultados de paralelismo. En conclusión, este método de extracción de cortisol de piel de koala proporcionó un ensayo no invasivo fiable que podría utilizarse para estudiar el estrés crónico en koalas.
Introduction
Los ecosistemas australianos sostienen la vida humana mediante la prestación de servicios como alimentos y fibra entre muchas otras interacciones dinámicas1. Irónicamente, es la actividad humana la que actúacomo el motor dominante de la interrupción del ecosistema a través del cambio de biodiversidad 2. La fragmentación del hábitat, conocida como el proceso de dividir grandes hábitats continuos en pequeños parchesde tierra, aislados entre sí, es el principal cambio de biodiversidad antropogénica que amenaza los ecosistemas australianos 2. La fragmentación del hábitat modifica la estructura y diversidad de la composición de lasespecies en cualquier área dada, reduciendo así el área de hábitat necesaria para que estas especies mantengan poblaciones viables 2. El resultado de esto es una mayor competencia entre especiespor recursos como alimentos, combustible, fibra y agua 3. La destrucción de los ecosistemas australianos a través del cambio de biodiversidad está teniendo consecuencias catastróficas en muchas especies nativas australianas1.
La especie marsupial más icónica de Australia, el koala (Phascolarctos cinereus), depende de que los ecosistemas australianos permanezcan sanos para su supervivencia4. La introducción del Asentamiento Europeo provocó una rápida disminución de las poblaciones australianas de koalas, ya que fueron sacrificados por sus pelts en busca de beneficios en un gran comercio de exportación5. Esta práctica fue prohibida en la década de 1980 y las poblaciones de koalas fueron capaces de estabilizar5. Sin embargo, el crecimiento exponencial de la población humana ha dado lugar a que esta especie compita por gran parte de su hábitat, y su supervivencia está de nuevo bajo amenaza6. Según la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), todas las poblaciones de koalas australianas están catalogadas como vulnerables a la extinción con una tendencia poblacional decreciente7. Esta lista se atribuye a la incertidumbre en torno a losparámetros de población relevantes y a la marcada variación de las tendencias de población de esta especie 7. Como los animales más emblemáticos y endémicos, los koalas benefician en gran medida a la economía australiana a través del turismo (Oficina de Medio Ambiente y Patrimonio 2018). Una estimación sugiere que el turismo relacionado con el koala ha generado aproximadamente 9.000 puestos de trabajo y contribuye entre $1.1 y $2.500 millones a la economía (Oficina de Medio Ambiente y Patrimonio de la NSW 2018). La eliminación de cualquier especie tiene el potencial de ser catastrófica, y se puede ver en el declive constante de la fauna nativa australiana6. Además, la economía de Australia sentirá las ramificaciones si las poblaciones de koalas australianos siguen disminuyendo al ritmo de6.
Se sugiere que la prevalencia de la muerte y laenfermedad en respuesta a la fragmentación del hábitat es el resultado del estrés crónico 8. Ya veinticuatro especies marsupiales han sido declaradas extintas en Australiadebido a la fragmentación del hábitat, con koalas siguiendo una tendencia similar 8. La complejidad de la fragmentación del hábitat y los sistemas biológicos es sinérgica, pero se puede desempaquetar mediante el análisis de la respuesta al estrés6. En general, cualquier perturbación en un entorno natural de los animales activa una compleja cascada de eventos neurohormonales, conocidos como respuesta de “lucha o huida”9,10. Esta respuesta al estrés es un proceso que comienza en el cerebro donde se activa el eje hipotalámico-hipófisis-adrenal (HPA)11. Un componente del cerebro llamado hipotálamo libera hormona liberadora de corticotrofina (CRH), que luego señala a la hipófisis anterior para liberar la hormona adrenocorticotrófica (ACTH)11. Esto a su vez estimula la secreción de glucocorticoides de la médula suprarrenal. El cuerpo circula glucocorticoides a través de la sangre, lo que desvía el almacenamiento de glucosa del glucógeno y moviliza la glucosa del glucógeno almacenado11. Esta cascada de eventos neurohormonales es la respuesta utilizada por el animal para hacer frente a estímulos impredecibles11. Sin embargo, cuando los glucocorticoides están siendo liberados y permanecen elevados durante un período prolongado de tiempo, el animal se considera que está experimentando estrés crónico12,13. Este proceso implica desviar la energía de otras funciones corporales corporales, ya que es necesaria para la producción continua de glucocorticoides13. Como resultado, el estrés crónico puede prohibir el crecimiento, la reproducción y la inmunidad, siendo todos los rasgos de aptitud clave necesarios para la supervivencia14.
Medir la producción de glucocorticoides de un animal es un indicador común utilizado para determinar si el animal está experimentando o no estrés fisiológico15. Para ello, los glucocorticoides se pueden medir en plasma sanguíneo, suero, saliva, orina o heces16. Sin embargo, la evidencia sugiere que el cabello es un indicador mucho más eficaz de estrés crónico, a diferencia de los16antes mencionados. Esto se debe a que el cabello se piensa para incorporar hormonas transmitidas por la sangre durante su fase de crecimiento; es relativamente estable; y cualquier cortisol detectado en el cabello refleja el estrés fisiológico experimentado durante el período de crecimiento del cabello, que puede ser semanas hasta los meses16. Además, cualquier colección de cortisol debe ser no invasiva para minimizar el estrés asociado con la captura y manipulación16. Sin embargo, cualquier estrés experimentado durante este evento no afectaría los niveles de glucocorticoides en el cabello16. Ha habido muchos estudios que exploran el dominio del uso del cabello para medir el estrés a largo plazo en un número de animales, e incluyen estudios sobre renos, osos pardos, monos rhesus, muskoxen, y osos marrones17,18, 19 , 20 , 21. El cortisol capilar generalmente se extrae lavando primero la muestra para asegurar que el sudor y el cortisol derivado del sebo depositados en la superficie del cabello no se extraigan con cortisol y luego pulverizan la muestra en un batidor de cuentas22. Después del lavado, la muestra debe secarse para asegurar la evaporación completa22. Por último, utilizando un disolvente, la muestra se puede extraer y reconstituir para facilitar el ensayo de cortisol22. El disolvente más común utilizado para extraer cortisol de piel es el metanol21,23; sin embargo, hay algunos estudios que utilizan etanol e isopropanol en sus técnicas de extracción de cortisol. Por ejemplo, un estudio que utilizó etanol tuvo éxito para extraer cortisol del líquido amniótico humano24. Además, un estudio que utilizó isopropanol fue exitoso para extraer cortisol del cabello humano y las uñas25,26. Por esta razón, este estudio probó los tres disolventes (metanol, etanol e isopropanol) para determinar cuál fue el más exitoso para la extracción de cortisol de muestras de piel de koala.
El objetivo principal de este estudio fue utilizar técnicas actuales para validar una técnica óptima de extracción hormonal que se utilizará como una medida no invasiva de cortisol de piel de koala. Esto se logró mediante el ensayo de tres disolventes de extracción (metanol, etanol e isopropanol). Hemos planteado la hipótesis de que el metanol será el disolvente óptimo utilizado para extraer cortisol de piel de koala porque es el disolvente recomendado de extracción por Arbor ensayo kits de cortisol27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay una serie de estudios que utilizan una serie de técnicas para detectar cortisol en piel de mamífero. Este estudio presenta resultados para la detección de cortisol en pieles recogidas de un koala salvaje expuesto al estrés antropogénico actual. Este estudio innovador utilizó el pelaje para probar cuáles de los tres disolventes comúnmente utilizados son los mejores en la extracción de cortisol, una medida de estrés crónico, de piel de koala. Los resultados mostraron que el 100% de metanol era el disolvente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado a través de fondos de investigación para Edward Narayan a través de la Western Sydney University, School of Science and Health. Los autores agradecen a Jack Nakhoul por su ayuda con el procesamiento de muestras.
Materials
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
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