Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli
Summary
Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.
Abstract
Enterokolit Nekroze edici (NEC), yeni doğan bebeklerin yıkıcı bir hastalıktır. Artan bağırsak geçirgenliği için önde gelen insan bağırsak epitel içinde birden çok Etyopatogenezi değişiklikler ile karakterize, restitüsyon engelliler ve hücre ölümü arttı. NEC çok sayıda hayvan modelleri olmakla birlikte, yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Ayrıca, hastalık patofizyolojisi veya insan denekler, özellikle çocuklar doğrudan roman terapötik ajanlar çalışmaya etik meydan okuyor. Bu nedenle, insan dokusu kullanarak NEC yeni bir model geliştirmek için son derece arzu edilir. Enteroids bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen 3 boyutlu organoids vardır. Karmaşık fizyolojik etkileşimleri, hücre sinyallemesi ve ana bilgisayar-patojen savunma çalışma için idealdir. Bu el yazması biz o kültürlerin insan enteroids bağırsak rezeksiyonu geçiren hastaların bağırsak kök hücreleri izole sonra bir iletişim kuralı tanımlamak. Crypt hücre farklılaşması çeşitli hücre türleri yerli bir insan bağırsak epitel içine teşvik büyüme faktörleri içeren medya kültürlü. Bu hücreler ekstra hücresel membran taklit eden bir iskele hizmet proteinler kolajen, sentetik karışımı yetiştirilmektedir. Sonuç olarak, enteroids demiri apikal polarite geliştirmek. Lipopolysaccharide (LPS) medya ortak yönetim enteroids, histolojik, genetik için önde gelen ve protein ifade değişiklikler bu insan NEC görülen benzer bir enflamatuar yanıt neden olur. Biz bu hastalık için bir tedavi tanımlamak için çalışıyoruz gibi insan dokusu kullanarak NEC deneysel bir model uyuşturucu ve insan denemeler önce test tedavi için daha doğru bir platform sağlar.
Introduction
İnsan enteroids olan ex vivo 3 boyutlu kültür sistem kök hücreleri insan intestinal doku örnekleri bağırsak kriptalarının izole. Bu çığır açan model 2007 aşağıdaki fareler1bağırsakta kriptalarının, Lgr5 + kök hücre keşfi Hans Clevers vd tarafından öncülük. İşlerini eski bir kurmak için temeli atıldı vivo bağırsak epitel kültür önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged birden çok hücre tiplerinin. Keşfinden bu yana enteroids, normal sindirim fizyolojisi ve inflamatuvar barsak hastalığı, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve rejeneratif tıp2gibi bağırsak hastalıkları Patofizyoloji çalışmaya yeni bir model olarak kullanılmıştır.
Kullanım eski bir olarak enteroids in vivo modeli bağırsak patofizyolojisi incelenmesi için alternatif teknikleri üzerinde birçok avantajı vardır. Son birkaç on yıl için hayvan modelleri ve ölümsüzleştirdi bağırsak kanseri türetilmiş hücre hatları bağırsak fizyolojisi3,4,5eğitim için kullanılmaktadır. Tek hücre kültürleri böylece hücre-hücre çapraz-hadis ve segment-özgüllük protein ifade, sinyal ve patojen kaynaklı hastalık6eksik hücre tipleri içinde normal bağırsak epiteli, mevcut çeşitliliği temsil etmemektedir. Enteroids kök hücre Binbaşı epitel hücre tipleri enterositler, Paneth hücreleri, goblet hücreleri, enteroendocrine hücreleri ve daha fazla3gibi ayırt etmek. Onlar polarite sergi, epitel taşıma iþlevlerini ve bağırsak segment özgüllük6için izin. Enteroids insan bağırsak epitel birden çok hücre türleri özetlemek beri onlar kanser hücre tabanlı sistemler tanınan bu sınırlamayı aşmak mümkündür. Zamanla, hücre hatları türevleri subcloned ve protein ifade ve Yerelleştirme3daha fazla çeşitlilik gösteren gelişmeye. Aksine, enteroids önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged. NEC için çok sayıda hayvan modelleri mevcut olmasına rağmen yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Bu sınırlamalar bir sonucu olarak, hayvan modellerden elde edilen tedavi başarısız zaman % 90 toksisite veya etkinliği3farklılıkları nedeniyle insan çalışmalarda test edilirken. Enteroids daha iyi bir karmaşık bağırsak patofizyolojisi ve bu nedenle, daha fazla anlayış için önde gelen bu yetersizliklerin üstesinden gelebilir umut verici önceden klinik modelleri hizmet başarılı ve uygun maliyetli tedavi yenilikler. Biyolojik açıdan önemli7yaşında bir enteroid kaynaklandığı doku kalır son kanıtlar da vardır. Enteroids böylece NEC ile hastaların fizyolojik alaka Bakımı, Yenidoğan dokusundan üretilen bu yana bu modelimiz için özellikle önemli bir ayrıntı var.
Enteroids yardımcı programı gibi modelleri insan hastalıkların tedavileri şiddetli ve yaygın koşullarına inanışı genişletmeye devam ediyor. Enterokolit Nekroze edici (NEC) tarafından bağırsak nekroz ile karakterize ventilasyon yıkıcı bir bağırsak hastalığı ve sık sık için bağırsak duvarı, septisemi ve ölüm8delikli açar. NEC karmaşık ve multifaktöriyel Patofizyoloji nedeniyle hastalığın kesin mekanizması henüz tam aydınlatılmamıştır değil; Ancak, artan bağırsak geçirgenliği açıkça hastalık süreci8‘ karıştığı olmuştur. Verilen, NEC ve potansiyel terapötik ajanlar insan denekler, özellikle çocuklar etik meydan okuyor, bu insan yenidoğan dokusu kullanarak NEC biyolojik ilgili enteroid modeli kullanmak için son derece arzu edilir. Şimdiye kadar enteroids NEC çalışmada sınırlı bir role sahip. Bu iletişim kuralı ex vivo modeli nekrotizan enterokolit çalışma için bir roman olarak insan bağırsak dokusu örneklerinden elde edilen enteroids açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu roman ex vivo insan bağırsak enteroid modeli bağırsak bariyer disfonksiyonu Nekroze edici enterokolit (NEC) içinde çalışma için yararlı bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Burada sunulan enteroid işleme yöntemleri Drs. Misty iyi, Michael Helmrath ve Jason Wertheim10,11,12önceki işten uyarlandı.
Ayrıntılar tüm çevreleyen doku toplama ve zamanlama crypt yalıtım bu protokolünd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü Enstitüsü diyabet ve sindirim ve böbrek hastalığı Grant (K08DK106450) ve C.J.H. için Amerikan Pediatrik cerrahi Derneği’nden Jay Grosfeld Ödülü tarafından desteklenmiştir
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
