תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

כל החולים בקרות בריא הסכים להשתתף biobank LUMC. שני המחקרים biobanking אושרו על ידי הוועדה האתית LUMC. 1. בידוד של נויטרופילים בריא להשיג 20 מ של דם היקפיים מתורם בריא שני צינורות מצופים EDTA 10 מ”ל. מכניסים צינור סטרילי 50 מ ל 10 מ”ל של דם ולהוסיף buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 32.5 מ ל. הוסף דחיסות צבע (למשל., Ficoll-amidotrizoaat) תחת התאים. תופסים 14 מ של דחיסות צבע עם 10 מ ל pipet, pipet בקר. מניחים את pipet על התחתון של הצינור 50 מ. לקחת את הבקר pipet הנחה pipet, המאפשר מעבר הצבע צפיפות לזרום מתוך pipet חוק המשיכה עד המרבי על ידי אפקט נימי (1-2 מ ל יישאר), ללא שימוש המנוע. הסר pipet על-ידי הצבת אגודל על גבי pipet, ובכך מונע צפיפות הדרגתי דולף החוצה במהלך הסרת pipet. לסובב את הצינורות כעשרים דקות ב 912 x g ובטמפרטורת החדר (RT) ללא האצה או בלם.הערה: תאי דם אדומים (RBC) ו נויטרופילים צפיפות גבוהה ונמצאות בחלק התחתון של הצינור 50 מ. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) הם נפרדו, על גבי המילוי ההדרגתי צפיפות כמו טבעת לבנה. פלזמה מדולל-PBS יהיה מעל PBMCs. אם יש צורך, PBMCs יכול להיות מבודדת על ידי העברת הטבעת לבן צינור 50 מ עם צעדים נוספים כביסה עם PBS. הסר בזהירות את הטבעת לבן המכיל PBMCs ראשון, ואחריו הסרת פלזמה מדולל-PBS ולבסוף את צפיפות השכבה הדרגתי ככל האפשר. כדי לבודד נויטרופילים מהתערובת נויטרופילים/אריתרוציטים, lyse אריתרוציטים מאת קר במים מזוקקים סטריליים. קח קר בקבוק מים מזוקקים סטריליים, סימן x 10 מרוכזים PBS הבקבוק מהמקרר. לעבוד מהר בשלב זה. להוסיף 36 מ”ל מים מזוקקים קרים סטרילי ישירות מעל בגדר ולערבב פעם אחת בקפידה. להוסיף 4 מיליליטר 10 x PBS לאחר 20 s כדי ליצור פתרון מול. מערבבים פעם אחת בקפידה. ספין צינור 5 דקות ב 739 x g ו- C ° 4 (להסרת RBCs). נויטרופילים יהיו בגדר לבן. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע. בצע שוב את שלב 1.6.2 וודא שבגדר מושעה כראוי. ספין צינור עבור 5 דקות ב 328 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של PBS. לספור נויטרופילים ולשמור אותם על קרח.הערה: התשואה הצפויה של דם (10 מ”ל) צינור 1 הוא כ- 15-75 מיליון נויטרופילים. 2. תא ניאון אדום תוויות של נויטרופילים להפוך השעיה נויטרופילים של 10-20 מיליון נויטרופילים ב 2 מ של PBS בשפופרת 15 מ”ל. להפוך את פתרון של 2 מ ל PBS עם 4 µL של 2 מיקרומטר תא ניאון אדום מקשר (ראה טבלה של חומרים) צינור שונה 15 מ”ל. להוסיף את זה בעדינות כדי ההשעיה נויטרופילים ומערבבים היטב. דגירה בחושך בדיוק 25 דקות ב 37 ° C כדי להדביק תווית נויטרופילים עם מקשר תא ניאון אדום. בטל תיוג על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני המכיל 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FCS) ב RT עד 15 mL ולערבב פעם בקפידה. ודא כי בגדר בקפידה resuspended אם גלולה הקימה. ספין צינור 5 דקות ב 328 x g ו- RT. הסר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 5 מ של פנול אדום ללא RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו-10% P/S-RT. נחשב נויטרופילים.הערה: תא הפסד של 50% יכולה להתרחש לאחר labelling תא ניאון אדום. 3. אינדוקציה של היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית להפוך את התא השעיה של 0.42 x 106 תאים למ”ל פנול אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S. להוסיף נויטרופילים 37,500 µL 90 לכל טוב בצלחת התחתונה 96-ובכן, שטוח שחור. להוסיף 10 µL הגירוי שבחרת (למשל, סרה של המטופל) דולר כדי להגיע בריכוז 10% בתוך הבאר. תמיד לכלול פקד שלילי (בינוני) בשלושה עותקים. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המבוקש, הנע בין 30 דקות ל 2, 4 או 6 ח’ המקננת במשך 4 שעות הוא הציע. לחשב את אמצעי האחסון הדרושים כדי להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום דנ א לצבוע (ראה טבלה של חומרים), כדי להגיע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבאר. להפוך predilution אם יש צורך RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S בריכוז 5 מיקרומטר. להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום DNA צבע 15 דקות לפני תום זמן הדגירה. המשך הדגירה למשך עוד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. הסר את תגובת שיקוע (~ 125 µL) היטב ולאחסן במידת הצורך. להוסיף 100 µL של 4% paraformaldehyde (PFA). גילינו ולהמשיך מיד בשלב 4. 4. נטו ויזואליזציה עם Immunofluorescence גבוהה-תוכן, רזולוציה גבוהה 3D מיקרוסקופיה קונפוקלית קביעת ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence על ידי לחיצה על הגדרת רכישה. לחץ על הכרטיסיה קביעת תצורה . בחר את המטרה ואת המצלמה. לבחור המטרה X Apo למבדה 10 עם מצב רכישה של הקדמוניות מיקרומטר 60 קונפוקלי. לחץ על צלחת , בחר את הצלחת 96-ובכן פלסטיק. בחר את האתרים כדי לבקר ובחר מספר קבוע של אתרים. מלאו 3 עמודות ושורות 3 ללא חפיפה (0 מיקרומטר), אשר מכסים את סך של 45% של הבאר. לחץ על רכישה. בחר לאפשר התמקדות מבוססת לייזר. בחר לרכוש סדרות סדרות/שעה Z במידת הצורך. לחץ על אתר פוקוס אוטומטי. לחץ על המוקד על צלחת התחתון | את הגדר על ידי עובי התחתון. על הבאר הראשונית למצוא את הדגימה, לבחור את הבאר הראשונה רכשה. פוקוס אוטומטי אתר, בחר ‘ כל האתרים. לחץ על אורכי גל. עבור המספר של אורכי גל, לבחור 2. TL הצללה תיקון עידון הרמה, לבחור 2. עבור גל 1, בחר טקסס אדום. עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z היסט, פוסט לייזר היסט 1.1 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10. גל 2, בחר FITC. עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z קיזוז מתוך w1 0 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10. עבור אפשרויות רכישה, בחר סדרת Z ו תמונה מוקרנת 2D המרבי. עבור אפשרויות רכישה, בחר תיקון הצללה | את. בחר סדרת Z. בחר את מספר שלבים: 10. בחר את גודל הצעד: 3 מ מ (טווח הכולל יהיה מיקרומטר 27). לשים את הצלחת קונפוקלית immunofluorescence. לחץ על הכרטיסיה הפעל . למלא את הצלחת שם ותיאור ובחר מיקום האחסון. בחר הבארות שצריך לרכוש. בחר זמן החשיפה FITC, טקסס אדום. לחץ על צלחת לרכוש כדי להפעיל את הרכישה, אשר יעביר כ 1 h לכל צלחת. 5. ניתוח של היווצרות נטו להשתמש בתמונה עיבוד תוכנית שנועדה לצורך ניתוח מדעי תמונות רב-ממדי (ראה טבלה של חומרים) לנתח את היווצרות נטו. להעביר את נתוני התמונה נרכשת כונן קשיח נפרדים. בחר את הצבע הוספת הכלי. בחר w1 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים. בחר w2 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים.הערה: להשתמש במאקרו סטנדרטית משתמשת w1 בשם הקובץ כדי להוסיף צבע אדום לתמונות טקסס אדום ומשתמש w2 להוסיף צבע ירוק התמונות FITC. בחר ניתוח מאקרו. בחר w1, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 100). בחר w2, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 500). בחר את מיקום היעד עבור קובץ גיליון אלקטרוני, להפעיל ניתוח ולשמור קבצי יומן רישום לאחר מכן. ניתוח נתונים בגיליון אלקטרוני.