Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

En última instancia se llevan a cabo actividades biológicas de proteínas, más que interactuar con otros para las funciones biológicas apropiadas. Usando un enfoque computacional, el importe total de las interacciones proteína-proteína en humanos se estima que 650.000 ~¹, y la interrupción de estas interacciones a menudo conduce a enfermedades². Debido a su papel esencial en el control de procesos celulares y organismos, se han desarrollado numerosos métodos para estudiar interacciones de proteínas, tales como levadura dos-híbrido, complementación bimolecular de la fluorescencia, split-luciferase complementación y co-inmunoprecipitación ensayo³. Mientras que estos métodos son buenos para descubrir y confirmar las interacciones proteína-proteína, son generalmente no-cuantitativos y así proporcionar información limitada sobre la afinidad entre los socios de proteínas interactuantes. Cuantitativas desplegables pueden utilizarse para medir la afinidad de unión (por ejemplo, la constante de disociación K_d), pero no mide la cinética de la Unión, ni se puede aplicar cuando el K_d es muy baja debido a una inadecuada relación señal a ruido⁴. Espectroscopia de la resonancia (SPR) de plasmón superficial cuantifica la cinética de Unión, pero se requiere una superficie específica y la inmovilización de un reactivo en la superficie, que puede potencialmente cambiar la propiedad de la fijación del reactivo⁵. Por otra parte, es difícil para el SPR medir rápida asociación y disociación tarifas⁵y no es apropiado utilizar SPR para caracterizar el evento de intercambio de subunidades de la proteína en un complejo proteico. Aquí, describimos un método que permite medir las tasas de proteínas complejo montaje y desmontaje en una escala de tiempo de milisegundos. Este método era fundamental para determinar el papel de Cullin –unsociado –Nedd8 –dissociated proteína 1 (Cand1) como el F-box proteína exchange factor^6,7.

Cand1 regula la dinámica de Skp1•Cul1•F-caja proteina (SCF) E3 ligasas, que pertenecen a la gran familia de ligasas de ubiquitina Cullin-anillo. Contratando consiste en el cullin Cul1, que une a la proteína de dominio de anillo Rbx1, y una proteína F-box intercambiable, que recluta a los sustratos y se une Cul1 a través de la proteína adaptador Skp1⁸. Como una ligasa E3, SCF cataliza la conjugación de ubiquitina a su sustrato, y se activa cuando el sustrato es reclutado por la proteína F-box, y cuando Cul1 es modificado por la proteína ubiquitina-como Nedd8⁹. Cand1 se une Cul1 sin modificar, y en Unión, altera tanto la Asociación de la proteína Skp1•F-caja con Cul1 y la conjugación de Nedd8 Cul1^10,11,12,13. Como resultado, Cand1 parece ser un inhibidor de la actividad SCF in vitro, pero la deficiencia de Cand1 en organismos causó defectos que sugiere un papel positivo de Cand1 en la regulación de las actividades SCF en vivo^{14,15,16 , 17}. esta paradoja fue finalmente explicada por un estudio cuantitativo que reveló las interacciones dinámicas entre proteína Cul1, Cand1 y caja de Skp1•F. Usando análisis de transferencia (traste) de energía de resonancia de la fluorescencia que detectan la formación de los complejos SCF y Cul1•Cand1, la asociación y disociación tasa constantes (k_el y k_fuera, respectivamente) fueron medido individualmente. Las mediciones revelaron que Cand1 y caja de Skp1•F forma muy apretado complejo proteico con Cul1 pero el k_fuera de SCF es aumentado por Cand1 y el k_fuera de Cul1•Cand1 es aumentado por proteínas de Skp1•F-caja de^6,7. Estos resultados proporcionan la ayuda inicial y fundamental para definir el papel de Cand1 como un factor de intercambio de proteína, que cataliza la formación de nuevos complejos SCF a través del reciclaje Cul1 de los viejos complejos SCF.

Aquí, presentamos el procedimiento de desarrollar y utilizar el ensayo de traste para estudiar la dinámica de los complejos de Cul1•Cand1⁷, y el mismo principio puede aplicarse para estudiar la dinámica de diversas biomoléculas. TRASTE se produce cuando un donante está entusiasmado con la longitud de onda adecuada, y con el espectro de excitación superposición el espectro de emisión del donador aceptor está presente dentro de una distancia de 10-100 Å. El estado excitado se transfiere al aceptador, de tal modo disminuyendo la intensidad de donantes y aumentar la intensidad aceptador del¹⁸. La eficacia de traste (E) depende del radio de Förster (R₀) y la distancia entre el donador y aceptor fluoróforos (r) y está definida por: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). El radio de Förster (R₀) depende de algunos factores, incluyendo la orientación angular del dipolo, la superposición espectral de la pareja donante-receptor y la solución utilizada¹⁹. Para aplicar el ensayo de traste en un Fluorímetro de flujo detenido, que supervisa el cambio de la emisión del donador en tiempo real y permite medidas de rápida k_el y k_fuera, es necesario establecer eficiente traste que resultados en una reducción significativa de emisiones de donantes. Por lo tanto, diseño eficiente traste seleccionando el par apropiado de tintes fluorescentes y los sitios de las proteínas de la blanco para fijar los tintes es importante y se discutirá en el presente Protocolo.