استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية
Summary
تفاعلات البروتين البروتين حاسمة بالنسبة للنظم البيولوجية، والدراسات المتعلقة بحركية ملزمة التبصير بديناميات ووظيفة البروتين المجمعات. يمكننا وصف أسلوب التي يوضحها المعلمات الحركية بروتين معقدة باستخدام أسلوب توقف تدفق ونقل الطاقة صدى الأسفار.
Abstract
البروتينات هي عوامل التشغيل الأساسي للنظم البيولوجية، وعادة ما تتفاعل مع غيرها الكلي أو الجزيئات الصغيرة الاضطلاع بوظائفها البيولوجية. يمكن أن تكون مثل هذه التفاعلات ديناميكية للغاية، بمعنى الوحدات الفرعية المتفاعلة المرتبطة باستمرار ونأت بأسعار معينة. بينما قياس تقارب ملزم باستخدام تقنيات مثل الكمية المنسدلة يكشف قوة التفاعل، دراسة حركية ملزم يقدم أفكاراً حول كيفية حمل يحدث التفاعل وكم من الوقت يمكن أن يتواجد كل مجمع. وعلاوة على ذلك، يساعد قياس حركية تفاعل حضور عامل إضافي، مثل عامل تبادل بروتين أو دواء، تكشف عن الآلية التي تنظم التفاعل العامل الآخر، توفير معلومات هامة النهوض بالبحوث الطبية والبيولوجية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لقياس حركية ملزمة البروتين المعقدة التي لديها نسبة عالية من رابطة جوهرية ويمكن أن تنفصل بسرعة بروتين آخر. يستخدم الأسلوب نقل الطاقة صدى الأسفار إلى تقرير تشكيل البروتين المجمع في المختبر، وأنه يمكن رصد رابطة سريعة والانفصال من المجمع في الوقت الحقيقي على فلوريميتير توقف تدفق. باستخدام هذا الفحص، كمياً الثوابت معدل الرابطة وتفكك البروتين المعقدة.
Introduction
في نهاية المطاف تنفذ الأنشطة البيولوجية بالبروتينات، أكثر منها التفاعل مع الآخرين للوظائف البيولوجية المناسبة. استخدام نهج حسابي، ويقدر المبلغ الإجمالي لتفاعلات البروتين البروتين في الإنسان تكون ~ 650,0001، وتعطل هذه التفاعلات غالباً ما يؤدي إلى أمراض2. بسبب أدوارها الأساسية في السيطرة على العمليات الخلوية والعضوي، تطورت أساليب عديدة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين، مثل الخميرة-اثنين-الهجين، والتكامل bimolecular الأسفار، سبليت-لوسيفراس التكامل، و الإنزيم co-إيمونوبريسيبيتيشن3. بينما هذه الأساليب جيدة في اكتشاف وتأكيد تفاعلات البروتين البروتين، وعادة غير كمي وهكذا توفر معلومات محدودة عن تقارب بين الشركاء البروتين المتفاعلة. هبوطاً سحب الكمية يمكن استخدامها لقياس تقارب ملزم (مثلاً، تفارق الثابت كد)، ولكن لا قياس حركية للتوثيق، ولا يمكن تطبيقها عند كد منخفضة للغاية نظراً عدم كفاية الإشارات إلى الضجيج نسبة4. مطيافية الرنين (موارد البرنامج الخاصة) السطحية مأكل مثل الطحين يوضحها حركية ملزمة، ولكن يتطلب سطح معين والتثبيت من مادة التفاعل واحد على السطح، والتي يحتمل أن تكون تغيير خاصية الربط من مادة التفاعل5. وعلاوة على ذلك، من الصعب على موارد البرنامج الخاصة لقياس رابطة سريعة و معدلات الانفصال5، وأنه من غير المناسب لاستخدام موارد البرنامج الخاصة لوصف هذا الحدث من تبادل مفارز بروتين في بروتين معقدة. هنا، نحن تصف أسلوب الذي يتيح قياس معدلات البروتين الجمعية المعقدة والتفكيك في مقياس زمني ميلي ثانية. وكان هذا الأسلوب ضروري لتحديد دور جالين-صمامات-Nedd8-دإيسوسياتيد البروتين 1 (Cand1)ك مربع و تبادل6،عامل البروتين7.
وينظم Cand1 ديناميات مربع Skp1•Cul1•F البروتين (SCF) E3 ليجاسيس، التي تنتمي إلى عائلة كبيرة من عصابة سنعمل ubiquitin ligases. سكفس تتألف من كولن Cul1، الذي يربط البروتين المجال الدائري Rbx1، وبروتين و مربع لتبادل، الذي يجند ركائز ويربط Cul1 عن طريق البروتين محول Skp18. ليجاسى E3، SCF يحفز على تصريف أوبيكويتين إلى أن الركيزة، ويتم تنشيطه عندما يتم تجنيد الركيزة بالبروتين و مربع، وعندما يتم تعديل Cul1 بالبروتين مثل أوبيكويتين Nedd89. يربط Cand1 Cul1 غير معدلة، وعند الربط، أنه يعطل كل رابطة البروتين مربع Skp1•F مع Cul1 وعلى تصريف Nedd8 Cul110،11،،من1213. كنتيجة لذلك، Cand1 على ما يبدو مثبط لنشاط صندوق إنقاذ الطفولة في المختبر، ولكن نقص Cand1 في الكائنات الحية بسبب العيوب التي تشير إلى دور إيجابي من Cand1 في تنظيم أنشطة صندوق إنقاذ الطفولة في فيفو14،،من1516 , 17-وأوضح هذه المفارقة أخيرا بدراسة كمية التي كشفت التفاعلات الدينامية بين البروتين Cul1، Cand1، و Skp1•F–مربع. استخدام fluorescence الرنين الطاقة نقل (الحنق) فحوصات الكشف عن تشكيل المجمعات SCF و Cul1•Cand1، رابطة وتفكك معدل الثوابت (كعلى kإيقاف، على التوالي) كانت تقاس على حدة. وكشفت القياسات أن Cand1 و Skp1•F–مربع البروتين شكل ضيق للغاية معقدة مع Cul1، ولكن كالخروج من صندوق إنقاذ الطفولة هو زيادة كبيرة من Cand1 و كالخروج من Cul1•Cand1 هو زيادة هائلة بمربع Skp1•F البروتين6،7. هذه النتائج توفير الدعم الأولى والحاسمة لتحديد دور Cand1 كعامل تبادل بروتين، مما يحفز تشكيل مجمعات SCF الجديدة من خلال إعادة التدوير Cul1 من مجمعات SCF القديمة.
هنا، نحن نقدم إجراءات لتطوير واستخدام مقايسة الحنق لدراسة ديناميات معقدة Cul1•Cand17، ويمكن تطبيق نفس المبدأ على دراسة ديناميات الجزيئات الحيوية المختلفة. بكى عند إحدى الجهات مانحة متحمس مع الطول الموجي المناسب، ويقبلون مع طيف الإثارة تداخل طيف انبعاث المانحة موجوداً ضمن مسافة 10-100. يتم تحويل الدولة متحمس يقبلون، وبالتالي تقليل كثافة المانحين وزيادة كثافة يقبلون18. كفاءة الحنق (ﻫ) يعتمد على دائرة نصف قطرها فورستر (ص0) والمسافة بين المانحين ويقبلون fluorophores (r)، ويتم تعريف بواسطة: E = 0ص6/(ص0 6 + ص6). دائرة نصف قطرها فورستر (ص0) يعتمد على عدد قليل من العوامل، بما في ذلك الاتجاه الزاوي ثنائي القطب، تستخدم التداخل الطيفي زوج يقبلون المانحين، والحل19. لتطبيق التحليل الحنق على فلوريميتير توقف التدفق، الذي يرصد تغير الانبعاثات المانحين في الوقت الحقيقي وتتيح قياسات سريعة كعلى و kإيقاف، من الضروري إثبات كفاءة الحنق التي النتائج في انخفاض كبير في انبعاثات المانحين. ولذلك، تصميم الحنق الكفاءة عن طريق اختيار الزوج المناسب الأصباغ الفلورية ومواقع على البروتينات المستهدفة تعلق الأصباغ مهم وسيتم مناقشتها في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
بكى ظاهرة الفيزيائية التي ذات أهمية كبيرة لدراسة وفهم النظم البيولوجية19. نقدم هنا، على بروتوكول لاختبار واستخدام الحنق لدراسة حركية ملزمة من اثنين من البروتينات المتفاعلة. عند تصميم الحنق، يمكننا النظر في ثلاثة عوامل رئيسية: التداخل الطيفي بين المانحين الانبعاثات ويقبلون ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر شو-أوو “ولاية شأن” (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) لمناقشة الثاقبة بشأن وضع مقايسة الحنق. الشخص، و Y.Z.، و X.L. ومولت أموال بدء التشغيل من جامعة بوردو إلى Y.Z. ودعم العمل X.L.This جزئيا بمنحه بذور من مركز جامعة بوردو “البيولوجيا النباتية”.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
References
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
- Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
- Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
- Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
- Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
- Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
- Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
- Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
- Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
- Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
- Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
- Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
- Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
- Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
- Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
- Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
- Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
- Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
- Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
- Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
- Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
- Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
- Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
- Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
- Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).
