מדידת לצורה ולגודל החלקיקים בוצה מופעל מרותק למיטה בטיפול אגר עם צינור תוכנה קוד פתוח
Summary
הגודל והצורה של חלקיקים ב בוצה מופעל הם פרמטרים חשובים זה נמדדים באמצעות שיטות שונות. אי דיוקים נובעים דגימה בלתי מייצג, שיוצרת תמונות ופרמטרים ניתוח סובייקטיבית. כדי למזער שגיאות אלה להקל על המדידה, אנו מציגים פרוטוקול ציון בכל שלב, כולל צינור תוכנה של קוד פתוח.
Abstract
ריאקטורים ניסיוני, כגון אלה לטיפול בשפכים, מכילים חלקיקים בגודל ובצורה של מי הם פרמטרים חשובים. לדוגמה, הגודל והצורה של בוצה מופעל flocs ניתן לציין את התנאים-microscale, משפיעים גם ישירות על מה טוב כל הטינופת בסבלך clarifier של ‘.
גודל החלקיקים צורה שתי מדידות בניגוד לשמו ‘פשוט’ בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. רבים בנושאים עדינים, לעיתים קרובות ללא התיחסות בפרוטוקולים פורמלי, יכול להיווצר כאשר הדגימה, הדמיה, ניתוח חלקיקים. שיטות דגימה עשויים להיות מוטים או אינם מספקים מספיק חשמל סטטיסטי. הדגימות עצמם ייתכן יישמרו לקוי או לעבור שינוי במהלך הנייח. תמונות אינה בהכרח באיכות טובה דיה; חופפים חלקיקים, עומק שדה, רמת הגדלה ו רעש שונים יכול כל לייצר תוצאות המסכן. ניתוח לקוי שצוין ניתן להטיה, כגון כי המיוצר על-ידי קביעת סף תמונה ידנית פילוח.
כל אחד מהחדרים מכיל ותפוקת הם רצויים לצד הפארמצבטית. שיטת תפוקה גבוהה, במחיר סביר יכול לאפשר מדידה חלקיקים בתדירות גבוהה יותר, הפקת תמונות רבות המכיל אלפי חלקיקים. שיטה המשתמשת ריאגנטים זולה, מיקרוסקופ ויבתר נפוצות וכן תוכנת ניתוח זמינה בחופשיות קוד פתוח מאפשר תוצאות ניסויית הדיר, נגיש, הדירים חלקית-ממוחשב. עוד, התוצר של השיטה יכולה להיות מעוצבת היטב, מוגדרים היטב, להבין בקלות על ידי תוכנת ניתוח נתונים, הקלות במרחק המעבדה ניתוחים והן שיתוף בין מעבדות נתונים.
אנו מציגים פרוטוקול לפירוט השלבים הדרושים כדי לייצר מוצר שכזה, לרבות: דגימה, לטעום הנייח אגר, ייבוא תמונות דיגיטליות, ניתוח תמונות דיגיטליות ו דוגמאות של דור איור ניסוי ספציפי מן והכנה תוצאות ניתוח. כללנו גם את צינור ניתוח נתונים פתוח כדי לתמוך בפרוטוקול זה.
Introduction
מטרת שיטה זו היא כדי לספק שיטה מוגדרים היטב, הדיר ו חלקית-ממוחשב לקביעת הפצות הגודל והצורה של חלקיקים בתוך ריאקטורים, במיוחד אלה המכילים flocs בוצה מופעל ואת בגרגרים אירובי1 , 2. הרציונל מאחורי שיטה זו היו כדי לשפר את מקלחון, פשטות, תפוקה, הדיר שלנו קיימים פרוטוקולים ללא צורך במיקור חוץ3,4, להקל על מדידת חלקיקים אחרים, וכדי להקל על שיתוף ועל השוואה של נתונים.
ישנן שתי קטגוריות כלליות של חלקיקים מדידה ניתוח – ישיר הדמיה הסקתית ושיטות באמצעות תכונות כאלה כמו פיזור אור5. למרות שיטות הסקתית יכול להיות אוטומטי ויש תפוקה גדולה, הציוד יקר. בנוסף, בעוד שיטות הסקתית ניתן לקבוע במדויק הגודל המקביל של חלקיקים6, הם אינם מספקים מידע מפורט צורה7.
בשל הצורך נתוני צורה, לנו בסיס השיטה שלנו על הדמיה ישירה. בעוד כמה שיטות הדמיה של תפוקה גבוהה קיימים, הם נדרשים באופן מסורתי חומרה מסחרי יקר או פתרונות מותאמים אישית הבנויה8,9. השיטה שלנו פותחה להעסיק משותף, במחירים סבירים חומרה ותוכנה זה, למרות סובל לירידה בתפוקה, מייצרת תמונות חלקיקים הרבה יותר מהמינימום הדרוש עבור ניתוחים רבים10.
קיימים פרוטוקולים עשויה לציין לא הדגימה חשוב והשלבים רכישת התמונה. פרוטוקולים אחרים עשויה לציין שלבים ידניים זה גורם להטיה סובייקטיביות (כגון קביעת סף אד הוק11). שיטה מוגדר היטב כי קביעת שלבי רכישת דגימה, קיבעון ותמונה בשילוב עם ניתוח זמינה בחופשיות תוכנה יהיה לשפר ניתוח תמונה בתוך-מעבדה וגם השוואות בין מעבדות. יעד מרכזי של פרוטוקול זה נועד לספק זרימת עבודה וכלים צריך להוביל לתוצאות לשחזור של מעבדות שונות באותה דגימת זרע.
מלבד נרמול תהליך ניתוח התמונה, הנתונים המיוצר על ידי צינור זה נרשם גם עם קובץ מוגדר היטב, מעוצבת היטב12 מתאים לשימוש על-ידי הנתונים הפופולריים ניתוח חבילות13,14, הקלות ניסוי ניתוחים ספציפיים (כגון יצירת דמות אישית) ונתונים והקלה על שיתוף בין מעבדות.
פרוטוקול זה במיוחד הוא הציע לחוקרים אשר דורשים נתוני צורה של חלקיקים, אין גישה לשיטות הסקתית, לא הייתי רוצה לפתח צינור ניתוח התמונה שלהם, ורוצים לשתף בקלות את הנתונים שלהם עם משתמשים אחרים
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות מערכת ניתוח התמונה היא די חסונים, QC הפעולות הננקטות כדי להבטיח תמונות המסכן יוסרו, תשומת לב המתאים הנושאים הספציפיים דגימה, הכנת צלחת, ייבוא תמונות יכול לשפר גם את הדיוק של הנתונים וגם היחס תמונות עובר QC.
ריכוז דגימה
בהנחה שנלקח מדגם מייצג, הוא הצעד החשוב ביו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של 1336544 CBET קרן המדע הלאומית.
הלוגוס פיג’י, R ופייתון משמשים עם בהתאם המדיניות סימן ההיכר הבאים:
פיתון: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , לפי רישיון CC-BY-SA 4.0 המפורטים ב: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
פיג ‘ י: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
- . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
