Mesurer la forme et la taille des particules de boues activées immobilisées dans la gélose avec un Pipeline de logiciels Open Source
Summary
La taille et la forme des particules dans les boues activées sont des paramètres importants qui sont mesurés à l’aide de différentes méthodes. Imprécisions proviennent d’échantillonnage non représentatif, images sous-optimal et paramètres de l’analyse subjective. Pour minimiser ces erreurs et faciliter la mesure, nous présentons un protocole spécifiant toutes les étapes, y compris un pipeline de logiciels open source.
Abstract
Bioréacteurs expérimentaux, tels que ceux traitant des eaux usées, contiennent des particules dont la taille et forme sont des paramètres importants. Par exemple, la taille et la forme des flocs de boues activées peuvent indiquer les conditions à la micro-échelle et affectent également directement comment bien la boue s’installe dans un clarificateur.
Forme et la taille des particules sont les deux mesures de façon trompeuse « simples ». Nombreuses questions subtiles, souvent non adressées dans les protocoles de l’informels, peuvent survenir lors de l’échantillonnage, imagerie et l’analyse des particules. Méthodes d’échantillonnage pourraient être biaisées ou ne fournissent pas assez de puissance statistique. Les exemples eux-mêmes peuvent être mal conservés ou subir une altération au cours de l’immobilisation. Images peuvent ne pas être d’une qualité suffisante ; chevauchement des particules, profondeur de champ, grossissement et divers bruits peut tous fruits et légumes des résultats médiocres. Analyse mal spécifié peut introduire un biais, tel que celui produit par segmentation et seuillage d’image manuel.
Abordabilité et le débit sont souhaitables aux côtés de reproductibilité. Une méthode abordable, haut débit peut permettent de mesurer les particules plus fréquente, produisant beaucoup d’images contenant des milliers de particules. Une méthode qui utilise des réactifs peu coûteux, un microscope à dissection commun et logiciel d’analyse de source ouverte librement disponible permet reproductibles, accessibles, reproductibles et partiellement automatisée des résultats expérimentaux. En outre, le produit d’une telle méthode peut être correctement mise en forme, bien définies et facilement comprise par le logiciel d’analyse de données, les analyses de laboratoire au sein et partage des données entre laboratoires d’accélération.
Nous présentons un protocole qui détaille les étapes nécessaires pour produire un tel produit, y compris : prélèvement, préparation des échantillons et immobilisation dans la gélose, acquisition d’images numériques, analyse d’image numérique et des exemples de génération de la figure de l’expérience spécifique de la résultats de l’analyse. Nous avons également inclus un pipeline d’analyse de données open source pour prendre en charge ce protocole.
Introduction
Le but de cette méthode est de fournir une méthode bien définie, reproductible et partiellement automatisée pour déterminer la taille et la forme des distributions de particules dans des bioréacteurs, particulièrement celles qui contiennent des flocons de boues activées et granules aérobie1 , 2. la raison d’être de cette méthode étaient d’améliorer l’accessibilité, de simplicité, de débit et répétabilité de nos protocoles internes existantes3,4, faciliter la mesure des particules pour les autres et de faciliter le partage et comparaison des données.
Il existe deux grandes catégories d’analyse de mesure des particules – méthodes déductives et direct d’imagerie utilisant des qualités telles que la diffusion de la lumière5. Bien que les méthodes déductives peuvent être automatisées et disposer d’un débit important, l’équipement est coûteux. En outre, alors que les méthodes déductives peuvent déterminer avec précision la taille équivalente d’une particule6, ils ne fournissent pas de forme détaillée d’informations7.
En raison de la nécessité pour les données de forme, nous avons fondé notre méthode sur imagerie directe. Alors que certaines méthodes d’imagerie haut débit existent, ils ont traditionnellement requis matériel commercial coûteux ou des solutions sur mesure construit8,9. Notre méthode a été développée pour utiliser une commune et abordable matérielle et logicielle qui, bien que souffrant d’une réduction de débit, produit des images de particules beaucoup plus que le minimum nécessaire pour nombreuses analyses10.
Les protocoles actuels ne peuvent pas spécifier d’échantillonnage important et image acquisition étapes. Autres protocoles peuvent spécifier des étapes manuelles qui biaisent subjectifs (par exemple ad hoc seuillage11). Une méthode bien définie qui spécifie les étapes d’acquisition d’échantillonnage, immobilisation et image associés au logiciel d’analyse disponible gratuitement améliorera les analyse dans le laboratoire d’images et des comparaisons entre les laboratoires. Des principaux objectifs du présent protocole sont de fournir un flux de travail et des outils qui devraient aboutir à des résultats reproductibles de laboratoires différents pour le même échantillon.
En dehors de la normaliser le processus d’analyse de l’image, les données produites par ce pipeline sont enregistrées dans un fichier bien définis, bien formatée12 approprié pour l’usage de données populaires analyse paquets13,14, expérience d’accélération des analyses spécifiques (par exemple de génération personnalisée de la figure) et facilite partage des données entre laboratoires.
Ce protocole est proposé en particulier pour les chercheurs qui ont besoin de données de forme de particules, n’ont pas accès aux méthodes déductives, ne souhaitent pas développer leur propre pipeline de l’analyse d’image et souhaitent partager leurs données facilement avec d’autres
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le système de l’analyse d’image est assez robuste et QC mesures sont prises pour s’assurer que les pauvres images sont supprimées, l’attention à des questions spécifiques à l’échantillonnage, la préparation de la plaque et acquisition d’images peut améliorer tant l’exactitude des données et la proportion de images en passant de QC.
Concentration d’échantillonnage
En supposant qu’un échantillon représentatif a été pris, l’étape la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation CBET 1336544.
Les logos de Fidji, R et Python sont utilisés avec l’en conformité avec les politiques de marques suivantes :
Python : https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , conformément à la licence CC-BY-SA 4.0 répertoriée au : https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fidji : https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
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