Summary

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

Published: March 21, 2020
doi:

Summary

מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.

Abstract

הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.

Introduction

נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים4. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מצב הפעלה LRRK2 קינאז והתחייבות היעד של מעכבי LRRK2 קינאז.

עד כה, הסמן העיקרי של פרמקוטיק לLRRK2 מעכבי ב vivo הייתה מקבץ של שאריות סרין בצורה מצטברת של LRRK2, בפרט סרין 935, אשר הפכו להיות בתגובה למעכבי LRRK2 שונים8,9. עם זאת, סרין 935 זרחון אינו מתאם עם פעילות פנימית LRRK2 קינאז הפנימי משום שהוא אינו זרחי במישרין על-ידי LRRK2 והוא עדיין זרחבקינאז-לא פעיל LRRK210. LRRK2 קינאז פעילות מתאימה היטב עם הוספולציה של סרין 1292, אבל זה במונחים מעשיים לא מתאים לפעילות אנדודוגני LRRK2 קינאז על-ידי ניתוח חיסוני כתמי של תמציות תאים שלמות בשל היעדר הנוכחי של נוגדנים אמינים ופוספוסקיים עבור אתר זה10,11.

פיתחנו שיטת חזק וקל לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול בתאי הדם היקפיים האדם המודד LRRK2 זרחון מבוקר של חלבון היעד הפיזיולוגי שלה Rab10 ב טראונין 7311. דם היקפי נגיש בקלות על ידי ונציה, שהוא סיכון נמוך והליך מהיר הגורם אי-נוחות מינימלית. אנו מתמקדים בגוף היקפי דם נויטרופילים כי הם מהווים שופע (37-80% של כל כדוריות הדם הלבנות) ואת האוכלוסייה תאים הומוגנית המבטא רמות גבוהות יחסית של שני LRRK2 ו Rab1011. יתר על כן, דם היקפי נויטרופילים יכול להיות מבודד במהירות וביעילות על ידי שימוש בגישה שלילית אימונוגנטית. כדי להבטיח כי הנצפים לאחר מכן Rab10 זילציה מתווכת על ידי LRRK2, כל אצווה של נויטרופילים הוא מודבטים עם או בלי חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכבי (אנו משתמשים וממליצים mli-2)2,12. זה ואחריו לאחר מכן הפירוק התא במאגר המכיל את מעכב פרוטאז diisopropyl fluorophosphate (difp), אשר הכרחי לדיכוי פעילות סרין פרוטאז מהותי כי ידוע להיות גבוה נויטרופילים13. לניתוח הסופי של האנליזה הכמותית, אנו ממליצים על שימוש בנוגדן MJFF-pRab10 הארנב שמזהה במפורש את Rab10 Thr73-פוספופאפיפ ואינו מגיב באמצעות חלבונים אחרים זרחתיים מסוג14. סלקטיביות וספציפיות של נוגדן זה אומת במודלים overexpression של חלבונים שונים של ראב ו A549 Rab10 לנקוש קו תא14. כך, אנו למדוד את ההבדל Rab10 זרחון ב נויטרופילים lysates כי כבר טופלו עם וללא חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכב2. לחילופין, ניתן לנתח דגימות גם בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטר מסה כמותי.

לסיכום, LRRK2 שבשליטת Rab10 זרחון הוא סמן מעולה של פעילות LRRK2 קינאז LRRK2 זרחון ב סרין 935 ו-היקפי הדם נויטרופילים היקפיים הם משאב רב ערך עבור מחקר PD לתוך LRRK2. הפרוטוקול שלנו מספק מעשה יציב וקל לחקור פעילות מסלול LRRK2 דם היקפיים נויטרופילים ומאפשר ריבוד ביוכימיים של אנשים עם פעילות מוגברת LRRK2 קינאז15. חשוב מכך, אנשים כאלה עשויים להפיק תועלת מטיפול מעכב LRRK2 קינאז עתידיים.

Protocol

על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת. 1. הכנה הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS). הכינו 60 mL של פתר?…

Representative Results

הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ?…

Discussion

הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון7. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות דם למחקר הנוכחי. אנו מודים לקרן מייקל ג’יי פוקס לחקר פרקינסון (MJFF) ולמנהיגות המחקר פוקס ביונט (FBN) לתמיכה ולכניסה לפרוטוקול הכתוב ולווידאו. אנו מודים לפרופסור אלכסנדר זיפריץ ‘ מאוניברסיטת וינה באוסטריה על בחינת הפרוטוקול ושיתוף הפעולה שלנו. אנו מעריכים את התרומות של פול דייוויס לפרויקט (מנהל כללי של MRC PPU). אנו מכירים גם את התמיכה הטכנית המצוינת של זרחון חלבון MRC והיחידה אוביקווילציה (PPU) כלומר סינתזה כימית (נטליה שפירו MLi-2), MRC PPU ריאגנטים ושירותים נוגדנים לטיהור צוותים (מתואם על ידי הילארי McLauchlan וג Hastie). אנו מודים מולר מטאולר ו פרייזר מרדוק מ Vivomotion עבור עזרתם עם עשיית קטעי וידאו ואנימציות. אנו מודים לסטיב סואב מ 81 סרטים לסיוע בעריכות הסופיות. אסתר סממלר נתמכת על ידי מלגת לימודים אקדמית בכירה סקוטית וקיבלה מימון של פרקינסון בבריטניה (K-1706).

Materials

1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 MJFF-total Rab10 mouse antibody

References

  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).

Play Video

Cite This Article
Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson’s Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

View Video