Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования
Summary
Мутации в леуцине богатые повторить киназы 2 гена (LRRK2) вызывают наследственное заболевание Паркинсона. Мы разработали простой и надежный метод оценки lRRK2 контролируемого фосфорилирования Rab10 в нейтрофилов периферической крови человека. Это может помочь определить людей с повышенной активностью пути киназы LRRK2.
Abstract
Лейцин богатый повторить киназу 2 (LRRK2) является наиболее часто мутировавшим геном в наследственной болезни Паркинсона (PD) и все патогенные мутации LRRK2 привести к гиперактивации его функции киназы. Здесь мы описываем простой и надежный анализ для количественной оценки lRRK2 киназы пути деятельности в нейтрофилов периферической крови человека путем измерения LRRK2 контролируемых фосфорилирования одного из своих физиологических субстратов, Rab10 на threonine 73. Описанный анализ иммуноблоттинга требует полностью селективного и фосфоспецифического антитела, которое распознает эпитопные фосфоры Rab10, такие как моноклональные антитела кролича MJFF-pRab10. Он использует нейтрофилы периферической крови человека, потому что периферическая кровь легко доступна и нейтрофилы являются обильным и однородным компонентом. Важно отметить, что нейтрофилы выражают относительно высокий уровень как LRRK2, так и Rab10. Потенциальным недостатком нейтрофилов является их высокая внутренняя активность протеазы серин, что требует использования очень мощных ингибиторов протеазы, таких как органофосфор нейротоксин diisopropylfluophosphate (DIFP) как часть буфера лизиса. Тем не менее, нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования активности пути киназы LRRK2 в vivo и должны быть рассмотрены для включения в коллекции PD биопозиторий.
Introduction
Попытки замедлить или остановить болезнь Паркинсона (PD) до сих пор не увенчались успехом. Открытие гиперактивации мутаций в лейцине богатых повторить киназу 2 (LRRK2), которые вызывают и / или увеличить риск для PD привело к развитию ингибиторов киназы LRRK21,2,3. Они уже вступили клинических испытаний4. Точная функция LRRK2 неясна, но основным прогрессом стало выявление подмножества белков Rab GTPase, включая Rab10, как первые добросовестные физиологические субстраты киназы LRRK25,6,7. Ключевыми проблемами в эпоху болезнеязычной терапии являются биохимические маркеры статуса активации активации LRRK2 и целевое участие ингибиторов киназы LRRK2.
До сих пор основным фармакокинетическим маркером для ингибиторов LRRK2 in vivo был кластер составно фосфорилированных остатков серина LRRK2, в частности, serine 935, которые становятся дефосфорилированными в ответ на различные ингибиторы LRRK28,9. Тем не менее, серин 935 фосфорилирования не коррелирует с внутренней клеточной активности киназы LRRK2, потому что это непосредственно не фосфорилируется LRRK2 и до сих пор фосфорилируется в киназе неактивных LRRK210. Активность киназы LRRK2 хорошо коррелирует с аутофосфорилированием серина 1292, но в практическом плане это не подходит для эндогенной активности киназы LRRK2 путем иммуноблотного анализа экстрактов цельных клеток из-за отсутствия надежных и фосфоспецифических антител для этого сайта10,11.
Мы разработали надежный и простой анализ для количественной оценки LRRK2 киназы пути деятельности в человеческих периферических клеток крови, что меры LRRK2 контролируемых фосфорилирования своего физиологического целевого белка Rab10 на threonine 7311. Периферическая кровь легко доступна с помощью шпинесекции, которая является низким риском и быстрой процедурой, которая вызывает минимальный дискомфорт. Мы фокусируемся на нейтрофилах периферической крови человека, потому что они составляют обильные (37-80% всех белых кровяных клеток) и однородную популяцию клеток, которая выражает относительно высокий уровень lRRK2 и Rab1011. Кроме того, периферийные нейтрофилы крови могут быть изолированы быстро и эффективно, используя иммуномагнитный негативный подход. Для обеспечения того, чтобы последующее наблюдаемое фосфорилирование Rab10 опосредовано LRRK2, каждая партия нейтрофилов инкубируется с или без мощного и селективного ингибитора киназы LRRK2 (мы используем и рекомендуем MLi-2)2,12. Затем следует клеточный лизис в буфере, содержащем ингибитор протеазы diisopropyl фторфосфат (DIFP), который необходим для подавления внутренней активности протеазы серина, которая, как известно, с высоким содержанием нейтрофилов13. Для окончательного анализа по количественному иммуноблоттингу, мы рекомендуем использовать моноклональное антитело кролика MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает Rab10 Thr73-фосфоэпитоп и не перекрестно реагирует с другими фосфорилированными белками Rab14. Избирательность и специфика этого антитела была подтверждена в моделях переэкспрессии различных белков Rab и A549 Rab10 нокаут омичи клеточной линии14. Таким образом, мы измеряем разницу в фосфорилировании Rab10 в нейтрофильных лизатах, которые лечились с мощным и селективным ингибитором киназы LRRK22. Кроме того, образцы могут быть проанализированы с помощью других методов, таких как количественная масс-спектрометрия.
В заключение, LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования является превосходным маркером LRRK2 киназы деятельности LRRK2 фосфорилирования на serine 935 и человека периферической крови нейтрофилов являются ценным ресурсом для ИССЛЕДОВАНИЯ PD в LRRK2. Наш протокол обеспечивает надежный и простой анализ для допроса LRRK2 пути деятельности в периферической крови нейтрофилов и позволяет биохимического стратификации лиц с повышенной активностью LRRK2 киназы15. Важно отметить, что такие люди могут извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Принудительные клинические, генетические и биохимические данные указывают на важную роль для LRRK2 и, в частности, его функции киназы при болезни Паркинсона7. LRRK2 ингибиторы киназы были разработаны и вступают клинических испытаний2,,4,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим здоровых добровольцев, которые любезно сдали кровь для настоящего исследования. Мы благодарим Фонд Майкла Джей Фокса по исследованию Паркинсона (MJFF) и руководство исследования Fox BioNet (FBN) за их поддержку и вклад в составление письменного протокола и видео. Мы благодарим профессора Александра Цимфрича из Венского университета в Австрии за тестирование нашего протокола и сотрудничество. Мы ценим вклад Пола Дэвиса в проект (генеральный менеджер MRC PPU). Мы также признаем отличную техническую поддержку MRC Protein Фосфорилирование и Ubiquitylation Unit (PPU), а именно химический синтез (Наталья Шпиро для синтеза MLi-2), MRC PPU реагентов и услуг иочистки антител групп (координируется Хилари Маклаухлан и Джеймс Хэсти). Мы благодарим Mhairi Towler и Фрейзера Мердока из Vivomotion за их помощь в создании видео и анимации. Мы благодарим Стива Соаве из 81 фильма за помощь в окончательной доработке. Эстер Саммлер поддерживается шотландским старшим клиническим академическим стипендией и получила финансирование от Великобритании Паркинсона (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
